[发明专利]一种R-环结合蛋白GST-His6

说明书

本发明提供一种R‑环结合蛋白GST‑His₆‑1/2×HBD及全基因组R‑环的检测方法，GST‑His₆‑1/2×HBD蛋白能够用于结合和定位R‑环，采用以下步骤制备：重组质粒GST‑His₆‑1/2×HBD的构建和提取；将重组质粒转入T7Express lysY/I^q感受态细胞，在2×YT培养基中培养并用IPTG诱导蛋白表达；使用Ni‑NTA beads亲和纯化GST‑His₆‑1/2×HBD蛋白。借助其对R‑环结构的特异性结合能力，运用靶向剪切及转座酶技术开发出少量细胞，操作简便，信噪比更高的R‑Loop CUTTAG，以便更好地绘制内源性R‑环基因组图谱，阐释R‑环在基因组中的功能。

技术领域

本发明属于核酸组学领域，具体涉及一种R-环结合蛋白GST-His₆-1/2×HBD及全基因组R-环的检测方法。

背景技术

R-环(R-Loop)是RNA侵入双链DNA所形成的一种特殊的三链核酸结构，包括一条DNA:RNA杂合链和一条单链DNA(single strand DNA，ssDNA)。起初R-环被认为只是转录过程形成的副产物，但是近些年的研究发现R-环在细菌、酵母和哺乳细胞中广泛存在，参与调控整个细胞周期，并在基因表达，染色质结构稳定和DNA损伤修复等过程中起着关键作用。与R-环在转录调控和DNA损伤修复的功能相对应，近年来R-环也被报道与许多疾病相关，比如神经性退行性疾病和癌症。例如，在乳腺癌细胞中，肿瘤抑制因子BRCA1或者BRCA2的突变会造成R-环的积累和DNA损伤的加重，这些R-环直接参与肿瘤的发生，同时也是基因组不稳定的标志。在骨髓增生异常综合征(MDS)的研究中，多种剪切因子的突变也会造成造血干细胞R-环水平的紊乱，从而影响基因组稳定性和细胞功能的正常维持。因此，这些证据表明R-环的异常可能是肿瘤发生的驱动因素之一。

然而，因为R-环功能的多样性，在总量上检测R-环水平的变化并不能阐释R-环在上述生理和病理过程中的作用机制。此外，R-环在转录和复制过程中的调控也显示出“亦正亦邪”的特质，因此近十年来许多研究团队一直在开发基因组水平上R-环的精确定位和定量方法。基于染色质免疫共沉淀技术，Chedin等(2012)首次利用识别DNA：RNA杂交体的S9.6单克隆抗体开发了体外富集R-环的高通量测序技术(DNA:RNA immunoprecipitation withdeep sequencing，DRIP-seq)；随后，陈亮等(2015)报道了另外一种基于RNASE H1突变体的R-环检测技术R-CHIP。这些方法虽然将R-环的检测带入了基因组学时代，但是不同检测策略映射出的R-环全基因组图谱存在着很大的差异。此外，这些方法都存在着实验周期长，操作步骤繁琐，信号背景差等缺点，在领域内无法形成一个R-环定位的“金标准”。

发明内容

本发明目的在于提供一种R-环结合蛋白GST-His₆-1/2×HBD及全基因组R-环的检测方法，将RNase H1的DNA：RNA杂种结合域HBD进行改良，通过将HBD结构域串联制备特异性识别R-环的重组蛋白GST-His₆-1/2×HBD。借助GST-His₆-2×HBD对R环结构更强的特异性结合能力，运用最新的靶向剪切及转座酶技术(Cleavage Under Targets andTagmentation，CUTTAG)进一步开发出少量细胞，操作简便，信噪比更高的R-Loop CUTTAG，以便更好地绘制内源性R-环基因组图谱，阐释R-环在基因组中的功能。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面提供一种全新的R-环结合蛋白GST-His₆-1/2×HBD，所述GST-His₆-1/2×HBD蛋白能够用于结合和定位R-环，其采用以下步骤制备：