[发明专利]一株深渊盐生单胞菌13199及其CRISPR-Cas系统和应用

说明书

本发明公开了一株深渊盐生单胞菌13199，其保藏编号为CGMCC 1.17396，分类命名是：Salinimonas profundi。该菌株是深海来源的细菌新物种，含有一个特殊的CRISPR‑Cas系统和大量的重金属抗性基因。其Cas蛋白与经过一定程度功能研究的高质量蛋白质数据库UniProtKB/Swiss‑Prot中收录的蛋白质序列同源性均低于65％，很可能具有不同的活性和特点。本发明的菌株Salinimonas profundi 13199及其CRISPR‑Cas系统是开发利用CRISPR‑Cas系统及进行相关研究的新颖材料，同时本发明的菌株在重金属污染环境修复制剂方面有一定的应用前景。

技术领域

本发明涉及一株深海来源的细菌菌株，具体为一株含有CRISPR-Cas系统的深渊盐生单胞菌13199及其CRISPR-Cas系统和应用。

背景技术

规律间隔成簇短回文重复序列及其相关蛋白(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats-CRISPR associated proteins, CRISPR-Cas）系统是原核生物基因组中一段特殊的DNA序列，发现于大约84%的古菌和47%的细菌中。一个完整的CRISPR-Cas系统包含三个功能元件：一系列Cas基因，一个前导区(Leader)和一个CRISPR阵列。

Leader一般位于CRISPR上游，是富含AT、长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR的启动子序列。CRISPR阵列由多个短而高度保守的重复序列区(Direct repeat,DR)和多个间隔区(Spacer)组成。DR长度一般为21～37 bp，含有回文序列，可形成发卡结构，数量有时超过100个。重复序列之间被长度为26～72bp的Spacer隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并被剪切使之表达沉默，达到保护自身的目的。Cas基因通常形成一个操纵子，位于CRISPR阵列的上游，可编码一系列Cas蛋白。目前发现的Cas蛋白包括Cas1～Cas13等多种类型。Cas基因与CRISPR共同进化，共同构成一个高度保守的系统。这些蛋白相互配合，共同完成Cas基因的表达、新Spacer的获得、外源核酸的识别和降解等过程。

根据使用的CRISPR RNA（crRNA）效应蛋白复合物的类型，CRIPSR-Cas系统分为Class 1（使用多效应蛋白）和2（使用单一效应蛋白）两个大类；根据Cas蛋白的组成和排布方式，又分为6个（I-VI）主要类型，并且不断有新的类型被发现。Class 1包括I、III和IV三个类型，编码多种蛋白发挥作用；Class 2包括II、V和VI三个类型，分别只编码Cas9、Cas12和Cas13一种蛋白便可以实现多效应蛋白符合物的所有功能。标志性的Cas蛋白是区分不同CRISPR-Cas系统的主要依据之一，是行使剪切目标DNA/RNA功能的蛋白，例如：I型使用Cas3，II型使用Cas9，III型使用Cas10，IV型使用Csf1，V型使用Cas12/Cpf1，VI型使用Cas13。在这些主要的类型中，又分为诸多亚型，不同的亚型有着不同的Cas蛋白和基因排布方式，主要的亚型有： I-A、I-B、I-C、I-U、I-D、I-E、I-F、II-A、II-B、II-C、III-A、III-B、III-C、III-D、V-A、V-B、V-C、V-D、V-E、V-U、VI-A、VI-B和VI-C等。几乎所有的CRISPR-Cas系统都能编码Cas1和Cas2蛋白，这两个蛋白主要是负责适应新的外源DNA/RNA并在CRISPR中插入新的Spacer。Cas1和Cas3是所有Cas蛋白中最为保守的，而其他Cas蛋白都具有很大程度的分化，这为CRISPR-Cas系统的分类带来了很多问题。但是多样化的Cas蛋白，也赋予了不同CRISPR-Cas系统不一样的特点，为人们开发利用CRISPR-Cas系统提供了更多的可能性。因此，寻找新型的CRISPR-Cas系统在其开发利用过程中是至关重要的环节。