[发明专利]真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因及其应用

说明书

本发明在甘蓝型油菜中克隆了一个病程相关蛋白(类甜蛋白Thaumatin‑like protein,TLP)和受体类激酶(Receptor‑like kinase)天然融合的基因BnTLK1。实验证实BnTLK1蛋白能够抑制核盘菌以及灰霉菌菌丝的生长，正调控真菌抗性。本发明为探索病原菌与植物互作中抗病基因的进化与功能研究奠定了基础，有助于解决生产上由菌核病造成的油菜产量和品质的巨大损失，能够为今后油菜等作物的定向分子设计和遗传改良创制新种质提供更多的备选方案。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因及其应用。

背景技术

新基因是指在物种进化过程中某个特定时间出现在以前不存在的位点上的基因，是具有新功能的DNA片段。新基因存在多种起源机制，包括基因复制、基因融合、基因分裂、从头合成起源以及基因水平转移等。1978年，GILBERT提出一个新基因形成的模型，即新基因可以由不相关的基因融合形成。融合基因指的是以前存在于不同基因的编码区经进化连在一起形成一个编码基因。基因融合事件约占所有原核基因的0.5％，绝大多数基因融合发生在细菌和真菌中，而在多倍体植物中融合基因的研究仍处于起始阶段。目前在植物中已经鉴定出一定数量的融合基因。在罂粟中催化吖啶生物碱合成第一步反应的去甲乌药碱合成酶(NCS)的催化域在DNA水平重复了2-4次从而形成了具有多个催化域的NCS融合基因，以提高NCS酶的催化活性；拟南芥编码的AK-HSD融合蛋白，由于连接区中存在跨越AK和HSD结构域的两个ACT结构域，能够受到苏氨酸的反馈抑制。综上所述，植物中通过基因融合产生的新基因能够强化原有基因的功能活性或者加强代谢网络的调控，对物种进化以及物种适应性具有重要意义。

油菜是我国重要的油料作物之一，菜籽油在我国食用油市场中具有举足轻重的地位。菌核病是油菜最严重的病害之一，能造成油菜植株早枯、角果减少、千粒重降低，严重影响油菜的产量和品质。油菜菌核病抗性主要受核基因控制，属微效多基因控制的复杂数量性状。因此聚合不同抗性位点是菌核病防控的有效策略。类甜蛋白(Thaumatin-likeproteins，TLP)是病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins，PR)家族的第5亚家族蛋白(PR5)。研究表明，TLP蛋白广泛参与植物应对生物胁迫和非生物胁迫过程。TLP功能的多样性一定程度上取决于其序列的多变性和复杂性。除了典型的TLP结构域，即具有16个保守的半胱氨酸残基和REDDD结构，还存在非典型的TLP，如仅包括10个半胱氨酸残基的小TLP，以及C端与激酶融合的TLP-Kinase(TLP-K)等。TLP-K中的激酶属于富含丝氨酸苏氨酸类激酶，拟南芥中的研究表明PR5K(一种TLP-K)的激酶结构域在体外具有自我磷酸化功能，暗示该融合基因可能行使生物学功能。

目前虽然在水稻、高粱、小麦以及拟南芥等物种中均报道发现TLP-K融合基因，但是对其生物学功能并不清楚，对油菜中TLP-K融合基因BnTLK1的功能解析有助于解决生产上由菌核病造成的油菜产量和品质的巨大损失，能够为今后油菜等作物的定向分子设计和遗传改良创制新种质提供更多的备选方案。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种TLP-Kinase融合基因BnTLK1。利用原核表达系统在体外表达BnTLK1蛋白并纯化，通过培养皿抑菌实验证实BnTLK1蛋白能够抑制核盘菌以及灰霉菌菌丝的生长。在模式植物拟南芥中过表达BnTLK1获得的转基因阳性植株经活体接种实验证明病斑明显小于野生型，而抑制拟南芥内源TLK1基因的表达，病斑扩张程度要高于野生型，因此融合基因BnTLK1正调控真菌抗性。

本发明提供真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因，所述BnTLK1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述核苷酸序列进行同义突变，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1蛋白，所述BnTLK1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述氨基酸序列由SEQ ID NO.1的核苷酸序列编码。