[发明专利]通过空间转录组技术分析牙周炎免疫微环境的方法

权利要求书

1.一种通过空间转录组技术分析牙周炎免疫微环境的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)通过冰冻切片技术获得不同牙周炎患者及正常对照的牙周组织切片，

(2)通过空间转录组技术对每个组织样本进行测序，得到空间转录组数据；

(3)根据所述空间转录组数据进行标准数据分析，对所有检测到的牙周组织不同区域免疫微环境中的细胞种类构成进行分群、鉴定及有效定位，并对不同区域的原始基因的种类和表达情况进行进一步聚类与差异分析，以选出牙周炎免疫调控机制中的关键基因及相关分子信号通路。

2.如权利要求1所述的通过空间转录组技术分析牙周炎免疫微环境的方法，其特征在于，在步骤(2)中，通过空间转录组技术对每个组织切片中被载玻片捕获区域内的寡核苷酸链捕获并标记唯一分子标识符UMI和特殊空间条形码的mRNA进行测序，得到空间转录组数据。

3.如权利要求1所述的通过空间转录组技术分析牙周炎免疫微环境的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述根据所述空间转录组数据进行标准数据分析包括以下步骤：

对空间转录组数据采用Fastp软件过滤获得可直接用于后续分析的测序数据；

采用barcode处理算法，将过滤得到的统计测序数据中所包含的cell barcode信息及相对应的counts数进行统计，从而判断测序样本中实际检测到的点阵数，获得真实的空间转录组测序信息；

将测序数据中cellbarcode对应的reads比对到已知物种相对应的基因组，分析所测的未知序列与已知序列间的相似性与差异性，并获得与之比对的bam文件；

将上述包含有基因组比对后各种信息的bam文件进行转化，将文件中比对到同一基因上的单分子标签进行合并，并去除其中重复的UMI序列，得到每个基因对应的UMI数量，进而统计得到每个空间点阵所检测到的基因数，并在空间染色片中进行可视化展示。

4.如权利要求3所述的通过空间转录组技术分析牙周炎免疫微环境的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述对所有检测到的牙周组织不同区域免疫微环境中的细胞种类构成进行分群、鉴定及有效定位包括以下步骤：

基于PCA算法，将空间测序数据进行降维处理，得到二维/低维信息，利用t-SNE算法和UMAP算法，将几千个空间点阵中具有相似性的spot进行聚类，进而得到聚类亚群(cluster)，并在空间染色片中进行可视化展示；

通过对两两聚类簇间每个基因的log表达量进行Welcht-tests，得到top10的差异基因作为Marker基因候选，结合cellMarker数据库中已被验证过的Marker基因，最终鉴定出每个cluster的Marker基因。

5.如权利要求4所述的通过空间转录组技术分析牙周炎免疫微环境的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述对不同区域的原始基因的种类和表达情况进行进一步聚类与差异分析包括以下步骤：

借助clusterProfiler软件包将上述聚类簇的Marker基因与cellMarker数据库中的基因做富集分析，观察特定聚类簇富集于何种细胞类型，进而完成对细胞类型的鉴定；

将上述通过富集分析所得到的各聚类簇中具有明显差异表达的基因作为候选基因群，与各大数据库结合分析；

通过Gene Ontology数据库对候选基因的细胞组件、分子功能、生物过程进行分析；

利用KEGG数据库对候选基因进行Pathway Analysis，观察候选基因主要富集于哪些信号通路上；

将候选基因与DisGeNET数据库进行结合，通过富集分析观察候选基因与哪些疾病密切相关。