[发明专利]一种组织工程化牙槽骨组织及其制备方法

权利要求书

1.一种组织工程化牙槽骨组织，其特征在于：包括含有种子细胞和细胞外基质的细胞聚合体以及3D定制化支架材料。

2.根据权利要求1所述的一种组织工程化牙槽骨组织，其特征在于：所述种子细胞为骨髓间充质干细胞、牙周膜干细胞或脂肪干细胞。

3.一种权利要求1或2任一所述的组织工程化牙槽骨组织的制备方法，其特征在于：将种子细胞分离和培养、纯化和扩增后，制备含大量细胞外基质的干细胞聚合体，再将干细胞聚合体与支架材料复合、塑形，形成组织工程化牙槽骨组织。

4.根据权利要求3所述的一种组织工程化牙槽骨组织的制备方法，其特征在于：所述种子细胞分离和培养、纯化和扩增的方法为：

a.自髂骨处抽取3mL骨髓，加入到含800~1200 U/mL肝素钠的生理盐水中，摇晃后再加入1~1.2 g/mL的淋巴细胞分离液，离心后移除单核细胞白色膜状层，PBS洗涤，再离心后弃上清，加入干细胞培养液重悬，置于5%CO₂、37℃条件下进行培养，每隔1天换液1次，待细胞生长到75%~85%时传代，标记第一代骨髓间充质干细胞；

b.收集第三磨牙根中1/3牙周膜组织剪碎，以0.2~0.4g/L的I型胶原酶和0.2~0.4g/L的Dispase酶消化1~1.5小时至组织松散，过筛后得到单细胞悬液，离心后弃去上清液，再加入干细胞培养液重悬，置于5%CO₂、37℃条件下进行培养，每隔1天换液1次，待细胞生长到75%~85%时传代，标记第一代牙周膜干细胞；

c.自口腔颊脂垫、大腿或腹部皮下脂肪组织处抽取3-10 mL脂肪组织，放入含青、链霉素100U/mL的PBS于培养皿中浸泡、清洗3次，每次3-5min，将脂肪组织剪碎至1mm³，加入脂肪组织3倍体积的0.1-0.4% I型胶原酶，震荡，37℃消化1h，加培养基终止消化；用200μm、100μm滤网依次过滤，离心收集下层基质血管细胞混合物（SVF），PBS重悬，70μm滤网过滤，离心后弃上清液，加培养基重悬，接种于25cm²培养瓶中，置于5%CO₂、37℃条件下进行培养，每2天换液一次，待细胞生长达75%~85%时传代，标记第一代脂肪干细胞；d.种子细胞筛选：取第一代骨髓间充质干细胞、牙周膜干细胞或脂肪干细胞，以100~200个/mL的细胞密度接种，置于5%CO₂、37℃条件下进行培养，每隔1天换液1次，待细胞生长到75%~85%时传代，标记筛选后的种子细胞。

5.根据权利要求3所述的一种组织工程化牙槽骨组织的制备方法，其特征在于：所述干细胞聚合体的制备方法为：

a.将筛选后的种子细胞密度调整为1×10⁵~5×10⁵个/mL，加入干细胞聚合体培养液并置于5%CO₂、37℃孵箱内培养，每2~3天换液一次，持续培养2~3周，获得干细胞膜片；b.将2~8个干细胞膜片折叠、塑性，加入干细胞聚合体培养液，并置于5%CO₂、37℃孵箱内培养，每天半量换液，持续培养3~7天，获得干细胞聚合体。

6.根据权利要求3所述的一种组织工程化牙槽骨组织的制备方法，其特征在于：所述组织工程化牙槽骨组织的制备方法为：将干细胞聚合体与骨诱导支架材料混合、塑形，加入干细胞聚合体培养基，并置于5%CO₂、37℃孵箱内培养，每天半量换液，持续培养3~7天，干细胞聚合体与骨诱导支架材料完全复合，即获得组织工程化牙槽骨组织。

7.根据权利要求6所述的一种组织工程化牙槽骨组织的制备方法，其特征在于：所述骨诱导支架材料为3D定制化同种异体矿化骨支架及颗粒，直径为100~2000μm。

8.根据权利要求4-6任一所述的一种组织工程化牙槽骨组织的制备方法，其特征在于：所述干细胞培养液：10%FBS和含100U/mL青、链霉素的a-MEM培养液。

9.根据权利要求5或6所述的一种组织工程化牙槽骨组织的制备方法，其特征在于：所述干细胞聚合体培养液为加入50-100μg/mL抗坏血酸的干细胞培养液。