[发明专利]一种利用含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统及高表达重组蛋白的细胞

权利要求书

1.一种含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其特征在于：包括，

编码硒蛋白的基因在3'端非翻译区UTR的Sec插入序列SECIS，能识别开放阅读框内终止密码子TGA并翻译成硒代半胱氨酸；

制备pME-Hyg-sHF-特定蛋白-Sec-GPI-SECIS；

扩增人SELT基因的SECIS序列，并将特定蛋白基因序列与密码子TGA和人源CD59蛋白的GPI修饰序列及终止密码子TAA插入到NotI位点之后，即构建了含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统。

2.如权利要求1所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其特征在于：所述特定蛋白包括重组溶酶体酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶A中的一种或几种。

3.如权利要求1所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其特征在于：所述sHF表示为内质网信号序列加上带有His6-FLAG-标签。

4.如权利要求1～3任一所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其特征在于：还包括，将所述质粒转染到HEK293细胞中，并敲除PIGK基因。

5.如权利要求4所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其特征在于：所述敲除PIGK基因，其包括，

使用CRISPR/Cas9系统将HEK293细胞中PIGK基因敲除；

制备pX330-EGFP-PIGK-KO，转染后，获得PIGK-KO细胞；

将pPB-FRT-PGKp-PurodTK插入到PIGK-KO细胞的基因组中；

制备pPB-FRT-PurodTK-PIGK；

将pPB-FRT-PurodTK-PIGK与pCMV-hyPBase共转染到PIGK-KO细胞中，用嘌呤霉素进行培养；

加入pCMV-hyPBase和/或pCAG-FLBase-IRES-puroDNA，再用含MFIAU的培养基培养即可。

6.如权利要求5所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其特征在于：所述带有PIGK-KO细胞不具有WT等位基因。

7.一种含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的诱导方法，其特征在于：包括

加入硒元素诱导转染后的HEK293细胞的细胞膜表面GPI形式的蛋白表达，所述硒元素来源于亚硒酸钠。

8.如权利要求7所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的诱导方法，其特征在于：所述亚硒酸钠的浓度为1～3μM，对应的所述转染后的HEK293细胞的密度为1×10⁵。

9.用于制备含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的引物，其特征在于：所述引物包括序列SEQ NO.1～SEQ NO.4中的一种或几种。

10.用于制备含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的载体，其特征在于：所述载体包括特定蛋白-GPI、pME-Puro-sHF-特定蛋白-GPI、pME-Puro-sHF-特定蛋白-TGA-GPI、sHF-特定蛋白-GPI、sHF-特定蛋白-Sec、sHF-特定蛋白-Sec-GPI、sHF-特定蛋白-Cys-GPI、sHF-特定蛋白-Sec-GPI-SECIS、pME-Hyg-sHF-特定蛋白-GPI、pME-Hyg-sHF-特定蛋白-Sec-GPI-SECIS、pME-Hyg-sHF-特定蛋白-Cys-GPI-SECIS、pX330-EGFP-PIGK-KO、pPB-FRT-PGKp-PurodTK、pPB-FRT-PurodTK-PIGK、pCMV-hyPBase、ORF-UGA-GPI-UAA-SECIS中的一种或几种。