[发明专利]一种多温度单荧光通道多重实时荧光定量PCR仪及其检测方法

说明书

本发明公开了一种多温度单荧光通道多重实时荧光定量PCR仪及其检测方法。该PCR仪包括光学系统、温控系统、荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。所述温控系统包括N个退火温控模块，所述荧光信号采集系统同时收集在N个退火温度下对应M个引物探针组的荧光强度，所述荧光信号采集系统将实时采集到的荧光信号连接输送到计算机分析处理系统，所述计算机分析处理系统对荧光强度值进行处理，所述计算机分析处理系统根据计算得到的N个不同退火温度下的荧光强度值绘制不同引物探针的多条扩增曲线。本发明能在多个退火温度或延伸温度进行荧光信号收集和数据分析，配合上述的不同Tm值引物设计方案，从而实现单个通道多温度多重荧光定量PCR检测。

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，具体为一种多温度单荧光通道多重实时荧光定量PCR仪及其检测方法。

背景技术

PCR的基本原理是利用DNA在体外变性时会变成单链、低温时引物和单链按照碱基互补配对的原则退火，再调温度到DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶沿着磷酸到无碳糖的方向合成互补链的过程。

PCR反应基本由变性——退火——延伸三部分构成：

1)模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃以上一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA片段解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2)模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3)引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复循环变性、退火和延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需1～4分钟，2小时就能将目的基因扩增放大几百万倍。

现有各种优化改良后的PCR技术基本都遵从DNA模板解链、引物与解链模板的结合和聚合酶延伸三个步骤的基本原理。例如，等温扩增PCR通过多种酶解链DNA双链，引物与模板DNA结合，然后在聚合酶的作用下进行延伸。两步法PCR采用95℃变性，退火和延伸采用同一温度(50～65℃)，采用低温聚合酶在50～60℃下就能延伸，从而节约了反应时间。

1996年由美国公司推出的实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是一种采用荧光定量PCR仪对PCR反应温度进行控制，同时在扩增反应中加入荧光染料或荧光标记的特异性探针对PCR产物进行荧光信号搜集和分析，实现对初始模板核酸进行定量和定性检测的技术。

qPCR反应程序遵守PCR反应的变性、退火和延伸三个基本步骤。通常变性温度设置为95℃，退火设置为50～65℃，延伸温度设置为72℃，退火温度和延伸温度可以设置为同一温度(50～65℃)。在延伸程序中进行荧光信号收集。

qPCR检测结果数据通过软件分析，呈现，横坐标为循环数，纵坐标为荧光信号强度数据图形，如图1所示；图形内包含S形荧光扩增曲线、阈值线。S形荧光扩增曲线一般包括基线期、指数增长期、线性增长期和平台期。由于扩增效率、引物设计、模板浓度等原因，该扩增曲线可缺少线性增长期和平台期，不会缺少基线期和指数增长期。