[发明专利]高肿瘤突变负荷和微卫星不稳定参考品的制备方法及应用

权利要求书

1.高肿瘤突变负荷和微卫星不稳定参考品的制备方法，其特征在于，其以高TMB值的成对细胞系为基础，将MMR系统的部分或者全部基因敲除，再提取并纯化基因敲除后的细胞的DNA，最后按浓度梯度稀释成标准系列参考品。

2.根据权利要求1所述的高肿瘤突变负荷和微卫星不稳定参考品的制备方法，其特征在于，其包括如下详细步骤：

步骤S1，针对MMR系统设计特异的sgRNA；所述的特异的sgRNA靶向MMR系统的一个或几个或全部的基因；

步骤S2，通过体外转录或者化学合成得到步骤S1中设计的特异的sgRNA，并将sgRNA与Cas9蛋白复合形成核糖核蛋白复合物；

步骤S3，将步骤S2中获得的核糖核蛋白复合物转染至高TMB值的细胞中；

步骤S4，转染48小时后，收集转染后的细胞并进行单克隆培养增殖，再从增殖后的部分细胞中提取DNA检测基因敲除结果，选取达到预设敲除目标基因的细胞再进行扩大培养，得到细胞悬液；

步骤S5，取步骤S4中的细胞悬液进行DNA提取，再测定提取液中的DNA浓度，再将测定后的DNA和对照细胞的DNA按浓度梯度稀释后混合，制成标准系列参考品。

3.根据权利要求2所述的高肿瘤突变负荷和微卫星不稳定参考品的制备方法，其特征在于，所述的高TMB值的细胞是肿瘤细胞。

4.根据权利要求2所述的高肿瘤突变负荷和微卫星不稳定参考品的制备方法，其特征在于，所述的步骤S4中的单克隆培养增殖具体是先将转染后的细胞稀释到1-10个/ml，再将细胞悬液混匀，将混匀后的细胞悬液分散至多孔细胞培养板上进行培养。

5.根据权利要求2所述的高肿瘤突变负荷和微卫星不稳定参考品的制备方法，其特征在于，所述的步骤S4中的基因测定是向有单细胞克隆的孔中加入蛋白酶消化细胞，对消化后的细胞进行PCR，再采用sanger法测序。

6.根据权利要求2所述的高肿瘤突变负荷和微卫星不稳定参考品的制备方法，其特征在于，所述的步骤S5中的DNA浓度测定采用分光光度计测提取物的DNA浓度，测定标准为：

浓度：平均浓度20.0≤x≤60.0ng/μL；

OD260/280：测定值1.8≤x≤2.0，判定合格；

OD260/230：测定值1.5≤x≤5.0，判定合格。