[发明专利]检测微卫星BAT25位点稳定性的引物对、试剂盒及方法

说明书

本发明提供一种检测微卫星BAT25位点稳定性的引物对、试剂盒及方法。所述引物对具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列以及如SEQ ID NO:2所示的碱基序列。本发明的引物对检测灵敏度以及特异性都较高，采用本发明的引物进行HRM法检测微卫星BAT25位点稳定性时，准确、快速且成本低廉，能够满足临床需求，应用前景广泛。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种检测微卫星BAT25位点稳定性的引物对、试剂盒及方法。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内的恶性肿瘤疾病当中，其发病率高居第3位，死亡率在恶性肿瘤行列高居第2位，在消化道恶性肿瘤中占全球发病和死亡首位，严重威胁着人类的健康与生存。近年来随着中国民众生活方式及饮食结构的变化，它已成为我国消化系统发病率第二位，患病率第一位的恶性肿瘤。微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)是结直肠癌发病的重要原因，在预测肠癌患者预后及化疗反应方面也有重要作用，同时对Lynch综合征的诊断具有重要意义。

近年来，MSI的相关临床和基础方面研究取得较好的进展，对MSI与CRC的关系取得深入认识。2016年，美国国家癌症综合治疗联盟(NCCN)在《结直肠癌临床实践指南》(2016.V2)指出，Lynch综合征应行MSI或错配修复(mismatch repair，MMR)检测：1)70岁及以下诊断结直肠癌患者以及符合Bethesda指南的大于70岁患者均应行Lynch综合征肿瘤检测；2)所有Ⅱ期患者均应行MSI或MMR检测，因为MSI-H的Ⅱ期患者预后较好，且不会从5-氟尿嘧啶单药辅助治疗获益。对于具有MSI-H特征的Ⅱ期结肠癌，组织分化差不再认为是高危因素。此外，NCCN指南指出，对局部晚期、复发性或转移性的胃癌患者，考虑PD-1抑制剂治疗前，需行MSI或MMR检测。FDA已批准抗PD-1药pembrolizumab，用于不可切除或转移性MSI-H或dMMR的实体肿瘤的二线或后续治疗选择。BAT25是结直肠癌微卫星不稳定性检测的重要位点之一，当发生不稳定时单核苷酸重复数会出现改变。

目前，检测微卫星不稳定性的方法包括：MMR蛋白免疫组化法、DNA测序、片段分析法、高效液相色谱技术、高分辨率熔解曲线(high-resolution melt，HRM)法等。其中：片段分析法是目前公认的金标准方法；但该方法成本较高，检测时间较长，并且必须在价格昂贵的测序仪上进行分析，大部分实验室无法开展检测(V Deschoolmeester et al.，Detection of microsatellite instability in colorectal cancer using analternative multiplex assay of quasi-monomorphic mononucleotide markers，J MolDiagn，2008,10(2):154-9)。HRM法是基于核酸的物理性质进行分析，只需在常规PCR基础上增加一些饱和染料，熔解曲线的形状取决于GC含量、片段长度和产物序列，通过熔解曲线的差异即可分辨；样品经PCR扩增后直接进行HRM分析，PCR产物无需再转入其它分析装置，而直接在同一个PCR管内进行分析，实现闭管操作，具有快速、低成本、灵敏性高等优点，同时只需在荧光定量PCR仪上即可进行分析。然而，HRM法对引物设计的要求很高：引物既要有很好的特异性，又要求其扩增出的片段足够短，才能获得较好的检测灵敏度。基于此，HRM法还未成功应用于BAT25位点稳定性的检测。

发明内容

基于此，本发明的主要目的是提供一种检测微卫星BAT25位点稳定性的引物对、试剂盒及方法。采用本发明的引物对卫星BAT25位点稳定性进行检测，灵敏度高，特异性好。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种检测微卫星BAT25位点稳定性的引物对，所述引物具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列以及如SEQ ID NO:2所示的碱基序列。