[发明专利]7β羟基类固醇脱氢酶突变体及其在制备UDCA中的应用

说明书

本发明涉及一种7β羟基类固醇脱氢酶突变体及其在制备UDCA中的应用，属于酶工程技术领域，通过突变体文库构建及高通量筛选方法获得SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。通过易错PCR确定影响7β‑HSDH活性的关键氨基酸并进行定点饱和突变，筛选得到的7β羟基类固醇脱氢酶突变体SEQ ID NO：2可以将200mmol/L7‑KLCA99％转化为UDCA，基本达到工业化生产要求。

技术领域

本发明涉及来自梭状芽胞杆菌属(Clostridia)的一种7β-羟基类固醇脱氢酶的突变子、编码这些酶的序列、产生此类酶的方法，以及在熊去氧胆酸(UCDA)酶法合成中的用途。

背景技术

熊去氧胆酸(UDCA)是名贵中药熊胆所含的主要有效成分，在临床上用于治疗各种胆结石疾病，各种急慢性肝病。UCDA的合成方法主要有全化学合成法和化学-酶法结合法，起始原料一般为动物来源的胆酸(CA)或去氧胆酸(CDCA)。

UDCA的经典化学合成方法如下。因为化学氧化是非选择性的，所以必须借助酯化来保护3α-和7α-羟基。此外，7-酮石胆酸(7-KLCA)的还原用到金属钠或Pd/C催化氢化，选择性地，工业放大生产不易控制且不安全。

胆酸→3,7-二乙酰基胆酸甲酯→12酮-3,7-二乙酰基胆酸甲酯→CDCA→7-KLCA→UDCA

PCT/EP2009/002190描述了如下方法。使用12α-类固醇脱氢酶(12α-HSDH)选择性地将CA氧化为12酮-去氧胆酸(12酮-CDCA)，避免了两个保护步骤，但仍需要7-KLCA的还原步骤。

胆酸→12-酮-CDCA→CDCA→7-KLCA→UDCA

Monti,D.,等(Advanced synthesis and catalysis 2009,351,1303-1311)描述了另外一种酶促转化方法。通过7α-HSDH(脆弱杆菌)和12α-HSDH(tetra hedron,2006,62:4535-4539)将CA氧化成7,12-二酮-LCA，然后再用梭菌属的7β-HSDH(Biochim biophysActa,1981,665:262-269)还原形成12-酮-UDCA，最后通过wolff-kishner还原反应获得终产物。整个反应需要三个酶，以及辅酶再生系统(乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶)，过程复杂。因为催化反应的平衡问题，使得底物不可能完全转化，难以工业化应用。

CA→7，12-二酮-LCA→12-酮-UDCA→UDCA

Hirano和Masuda报道了来自产气科林斯菌的NADP⁺依赖性的7β-HSDH(ApplEnviron Microbiol,1982,43:1057-1063)。2011年Rolf D.Schmid和德国细胞制药公司将此7β-HSDH基因在大肠杆菌中高效表达，鉴定了酶学性质并用于还原7,12-二酮-LCA或者7-KLCA获得12-酮-UDCA或者UDCA(Appl Microbiol Biotechnol,2011,90:127-135),此酶表现出高选择性且不会形成副产物。继续优化后得到活性提高和去除底物抑制的突变子(CN201080062617，CN201180067680),重组酶的高转化率和高专一性使得UDCA酶法大规模生产成为可能。此外，华东理工大学许建和从扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torquesATCC35915)克隆表达了其7β-HSDH基因，此酶也具有与产气柯林斯菌来源的7β-HSDH相似的、对底物7-KLCA的高转化率和高特异性。尽管如此，上述不同来源的7β-HSDH催化的UDCA的合成反应，使用低的底物浓度(4～40g/L),而且在40g/L的底物浓度下转化率只有90％，产品收率仅71％；一般情况下，酶转化工艺使用100g/L或者更高底物浓度，且转化率接近100％，才视为具有工业化生产的意义，故表明此酶促反应离工业化大规模生产还有一定的距离。

发明内容