[发明专利]7β羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及一种7β羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域，通过突变体文库构建及高通量筛选方法获得SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。通过易错PCR确定影响7β‑HSDH活性的关键氨基酸并进行定点饱和突变，提高7β‑HSDH底物耐受浓度。突变后的7β‑HSDH底物耐受能力相对于原始7β‑HSDH明显增强，可以耐受200mmol/L的7‑酮‑石胆酸(7‑KLCA)底物浓度，本发明构建的突变体7β‑HSDH分泌能力增强的重组大肠杆菌可将7β‑HSDH酶活较出发菌株提高2.47倍。改造后的基因工程菌产酶能力显著提高，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。

技术领域

本发明涉及一种或几种易错PCR/定点饱和突变改造的7β羟基类固醇脱氢酶 (7β-HSDH)酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

熊去氧胆酸(UDCA)是用于治疗各种胆石疾病，各种急性、慢性肝病的有效药 物。UDCA传统制备方法是从熊胆汁中提取，但这种方法提取过程困难、产物收率 低、手段过于残忍，有违动物保护法。

当前，工业上生产UDCA的方法除了“熊胆提取法”外，主要有化学合成法和酶 法，其中化学合成法由于成本较高、工艺步骤多、“三废”严重和条件苛刻等缺点 已逐步被淘汰；而酶法具有成本较低、工艺简单、绿色无污染及反应条件温和等 优点，因此日益受到重视。

基于酶法制备UDCA的工艺入图2所示(参考文献：Latest development in thesynthesis of ursodeoxycholic acid(UDCA):a critical review)：

综合上述酶法路线，都需要在UDCA的制备过程中使用7β-HSDH作为生物催化 剂。但是作为UDCA制备工艺的关键酶，目前已报道的7β-HSDH十分有限，目前， 国内外科研工作者已经筛选出众多产7β-HSDH的微生物并将其编码基因克隆出 来，如活泼瘤胃菌属(Ruminococcus gnavus)、扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques ATCC 35915)、产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)、撒丁岛梭菌 (Clostridium absonum)等。但是这些7β-HSDH酶非常不稳定，在检测酶活时有 较好的酶活，而实际催化中根本不能承受稍高一点的底物浓度，各种不同来源的 7β-HSDH催化UDCA的合成所使用的底物浓度见表1，最高不到40g/L，且仅 为毫升级别的反应量，通过大量消耗酶量才能达到较高的转化率，而一般来说， 酶转化工艺至少达到50g/L或者更高的底物浓度，且酶催化体系达到公斤级， 才可以视为具有工业化生产的意义。针对酶蛋白提取纯化的成本偏高；关键酶的 稳定性差以及存在底物承载能力不够高等限制因素，目前的改进方式主要在采用 酶固定化来提高酶的稳定性及重复利用率，另外通过对反应器的改进，用流动系 统降低酶因为固定化机械应力而丧失的部分酶活。这些改进在一定程度上提高了 反应效率和综合转化率，但仍然没有在根本上解决关键酶稳定性差的问题，这极 大限制了UDCA制备工艺的开发。因此，挖掘和筛选催化性能良好、能够耐受高浓 度底物的7β-HSDH具有十分重要的意义。

表1 7β-HSDH催化合成UDCA现状