[发明专利]荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因及其引物和应用

说明书

本发明公开了荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因及其引物和应用。本发明选取4个荔枝霜疫霉基因PlACTIN、PLGAPDH、PlrpS5和Pl006400，通过实时荧光定量PCR的方法测定了这些基因在荔枝霜疫霉菌丝、孢子囊、游动孢子、休止孢、休止孢萌发和侵染个阶段的表达量变化，比较所选基因表达量稳定性，发现了Pl006400和PlACTIN表达量稳定可作为内参基因。本发明的内参基因Pl006400和PlACTIN的特异性引物引物可广泛应用于荔枝霜疫霉发育及其侵染荔枝各阶段的基因表达研究，填补了荔枝霜疫霉缺少可靠内参基因的空白，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因及其引物和应用。

背景技术

荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)所引起的荔枝霜疫病是荔枝上最严重的病害，在我国广东和广西等主要产区均有发生，每年的发病率大约在30％-90％之间，除了在荔枝生长期使其果实发病腐烂，造成落果，也会影响荔枝采摘后的保存，让荔枝在运输过程中大量发病，严重制约我国荔枝产业的发展。

实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性高和精确性高的优点，已被应用于分子生物学、医学、食品检测和环境监测等多个研究与应用领域。内参基因作为在荧光定量PCR分析中检测基因表达水平变化的参照物，其稳定性可决定实时荧光定量的分析结果的可靠性。因此，选取稳定、合适的内参基因对分析荔枝霜疫霉基因荧光定量PCR结果有较大意义。

目前，荔枝霜疫霉内参基因的开发筛选的工作一片空白，严重阻碍了荔枝霜疫病的分子生物学研究，若要对荔枝霜疫霉进行生长发育和致病机制研究，可靠内参基因鉴定的是至关重要的。

发明内容

本发明针对现有技术中缺乏稳定、合适的荔枝霜疫霉内参基因及其引物的不足，提供荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因及其引物和应用。

本发明比较了4个荔枝霜疫霉潜在的内参基因，通过荧光定量PCR发现了其中2个内参基因表达量较为稳定，可作为荔枝霜疫霉荧光定量PCR分析中的内参依据，分别是Pl006400和PlACTIN。所述的内参基因可用于荔枝霜疫霉基因表达研究。

本发明的第一个目的是提供荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因，为内参基因Pl006400或PlACTIN，所述的内参基因Pl006400，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述的内参基因PlACTIN，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供所述的荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因的特异性引物，所述的内参基因Pl006400的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.7和SEQID NO.8所示，所述的内参基因PlACTIN的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示。

本发明还提供所述的内参基因Pl006400或PlACTIN作为定量检测荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段基因表达的内参基因的应用。

本发明还提供所述的特异性引物作为定量检测荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段基因表达的内参基因特异性引物的应用。

本发明还提供所述的内参基因或所述的特异性引物在制备荧光定量试剂盒中的应用。

优选，所述的试剂盒还包括常规PCR试剂。

本发明具有以下优点：

本发明的荔枝霜疫霉生长发育和侵染阶段的内参基因Pl006400或PlACTIN及其特异性引物，可广泛应用于荔枝霜疫霉发育及其侵染荔枝各阶段的基因表达研究，填补了荔枝霜疫霉缺少可靠内参基因的空白，具有重要的应用价值。

附图说明

图1是Genorm对候选内参基因稳定性分析；