[发明专利]一株高产10-脱乙酰基巴卡亭III的东北红豆杉内生真菌

说明书

本发明涉及到从东北红豆杉(Taxus cuspidata)中分离得到的一株高产10‑脱乙酰基巴卡亭III的内生真菌草酸青霉Penicillium oxalicum R8‑3‑4，能够用于人工合成紫杉醇和多烯紫杉醇。本发明首次报道青霉属真菌产10‑脱乙酰基巴卡亭III紫衫烷类活性物质，产量为979.52μg/L，具有发酵周期短、产物种类多的优点，有较好的工业化前景。首次应用本发明首次应用磁性固定化技术稳定生产紫衫烷活性物质，为真菌发酵商业化生产最重要的抗癌药物开辟道路。

技术领域

本发明属于微生物技术、生物制药领域，特别涉及一株从红豆杉中分离获得的植物内生真菌，该菌株液体发酵液可高产10-脱乙酰基巴卡亭III，具有为人工合成多烯紫杉醇或紫杉醇提供可持续资源效果。

背景技术

癌症是全球严重威胁人类生命和社会发展主要的原因，近年来全球癌症负担持续增长，据2018年世界卫生组织统计数据显示，全球新增癌症患者达1810万人，癌症死亡人数约为960万人。中国是人口大国，也是癌症高发国家，2018年我国新发病例数380.4万例，占全球癌症新发病人数的20％以上，在过去五年中，中国每年癌症死亡人数由2014年的约230万人增至2018年的约260万人，预计2024年将达约300万人。紫杉醇类药物在世界各国均为医院首选的抗癌药物。迄今为止，还没有一种植物抗癌新药能取代其位置，自1967年被发现，是人类已知唯一一种可以促进微管蛋白聚合并抑制微管蛋白解体来发挥抗癌作用的药物。紫杉醇类药物在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗，并且随着对紫杉醇的深入研究，紫杉醇类药物还可以用于治疗牛皮癣、类风湿性关节炎及冠状动脉支架狭窄等疾病。虽然抗癌药物发展迅速，靶向药物依然受宠有加，细胞毒药物则热情不再。几乎每年都会有几个、甚至十几个靶向抗癌药物成功上市。然而，药物研发绝不等于临床使用(尤其是我国国内)，由于种种原因，医生针对癌症患者所开的用药处方中，仍以一些“一线老药”为主，“好而贵”的靶向药物的使用并未跟上药物研发的速度。故而，我国抗癌第一大药仍是多年使用的老药——紫杉醇和多烯紫杉醇。

目前国际上的紫杉醇和多烯紫杉醇市场供不应求，原料短缺问题日益严峻。然而，紫杉醇原料药主要有2种：一是从红豆杉树皮中提取的紫杉醇；二是从欧洲观赏紫杉枝条里提取出“10-脱乙酰基巴卡亭III”经半合成为紫杉醇衍生物“多西他赛”(多烯紫杉醇)。因为直接从红豆杉树皮中提取紫杉醇属于“不可持续的资源利用方式”并且天然的紫杉醇浓度约为0.02-0.069％，含量极低且品种间差异较大，即大约13.6kg的树皮仅能提出1g左右的紫杉醇，治疗一个卵巢癌患者需要3-12棵百年以上的红豆杉树。然而红豆杉作为我国珍稀濒危树种，是经过了第四纪冰川遗留下来的珍贵古老孑遗树种，生长极为缓慢，对气候变化、温度、光照、湿度的要求严格，对海拔、地理位置、坡向的因素的变化也较为敏感。为了改变当前资源不足的状况，科学家试图找到各种解决方案，包括人工种植红豆杉植物，化学合成，植物组织培养以及微生物发酵等。人工种植红豆杉产量较低且耗费人力，其中10亩仅能提炼1公斤纯度为1％的紫杉醇；化学合成费力且受成本高，收率低，对环境不友好的限制，难以达到商业应用的规模；植物组织培养很容易受到污染，需要苛刻的培养条件和高装备。微生物发酵是一种成熟的方法，具有周期短，成本低，易于控制生长条件，培养基简单，原料来源丰富等优点，可以代替红豆杉植物来解决其紫杉烷类供应问题。内生真菌是新颖重要的次生代谢产物宝库，在制药工业中具有巨大的潜在应用。一旦达到合适的生长条件，就可以以相对较高的效率获得内生菌产生的生物活性物质，并更容易分离纯化。此外，内生真菌发酵产生具有生物活性的次生代谢产物不受季节，气候和地理条件的限制。