[发明专利]一种超薄型Ⅰ/Ⅱ型胶原复合支架及其制备方法

权利要求书

1.一种超薄型Ⅰ/Ⅱ型胶原复合支架，其特征在于：从猪跟腱中提取I型胶原，从猪关节软骨中提取II型胶原,再利用盖玻片压胶原结合真空冻干的方法制作上层致密下层疏松的双层胶原支架，其中上层为I型胶原层，下层为II型胶原层，通过EDC/NHS对其交联以使其结构稳定。

2.一种超薄型Ⅰ/Ⅱ型胶原复合支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取I型胶原蛋白；

（2）提取II型胶原蛋白；

（3）制造模具；

（4）I/II型胶原复合支架制备。

3.根据权利要求2所述的一种超薄型Ⅰ/Ⅱ型胶原复合支架的制备方法，其特征在于，所述I型胶原蛋白制备方法如下：

（1）取新鲜猪跟腱，经超纯水清洗多次，修剪杂质后继续清洗多次；

（2）剪碎猪跟腱组织，放入75%酒精中浸泡脱脂10min，经超纯水清洗多次后置于0.05mol/L乙酸溶液，取出后用磁力搅拌器在4℃下将其搅拌24小时；

（3）将步骤（2）处理后的猪跟腱碎块用搅碎机搅至呈乳胶状液体并收集在1升烧杯中；

（4）烧杯中加入1g/L胃蛋白酶混合，用磁力搅拌器在4℃下搅拌3天；

（5）将步骤（4）中烧杯内混合液经40目钢筛网过滤，取清液；

（6）将清液在4℃低温下经15000r/m高速离心机离心30min后加入1/4液体质量的NaCl，经磁力搅拌器搅拌，在4℃下盐析24h；

（7）将步骤（6）处理后的清液再一次在4℃低温下经12000r/m高速离心机离心30min后弃去上清液，收集沉淀放入透析袋加大量超纯水透析36h，每6h更换一次纯水；

（8）将透析产物平铺于培养皿，使用真空冻干机去除胶原中的气泡后置于4℃冷藏箱中静置24小时密封保存，即得精制I型胶原凝胶。

4.根据权利要求2所述的一种超薄型Ⅰ/Ⅱ型胶原复合支架的制备方法，其特征在于，所述II型胶原蛋白制备方法如下：

（1）取新鲜猪关节软骨,放入75%酒精中浸泡脱脂10min；

（2）将步骤（1）脱脂后的猪关节软骨经超纯水清洗多次后，放入10到15倍体积的4M/L盐酸胍去糖蛋白中搅拌后静置24h；

（3）将步骤（2）处理后的猪关节软骨用0.5mol/L乙酸洗净后，用搅碎机将其搅碎至乳胶状液体并收集在1升烧杯中，再加入1 g/L胃蛋白酶用磁力搅拌器搅拌24h；

（4）将烧杯放入离心机11000r/min离心10 min去掉酶等杂质，留取上清液；

（5）在上清液中加入 2 mol/L NaOH ，使其酸碱度迅速调节至 pH 7；

（6）将步骤（5）处理后的上清液经钢丝滤网过滤掉残渣后，加入Nacl调节浓度至3mol/L,盐析30min；

（7）将步骤（6）处理后的上清液在4℃低温下经12000r/m高速离心机离心30min收集沉淀放入透析袋加大量超纯水透析48h，每6h更换一次纯水；

（8）将透析产物平铺于培养皿，使用真空冻干机去除胶原中的气泡后置于4℃冷藏箱中静置24小时密封保存，即得精制II型胶原凝胶。

5.根据权利要求2所述的一种超薄型Ⅰ/Ⅱ型胶原复合支架的制备方法，其特征在于，所述制造模具方法如下：

（1）利用一片普通盖玻片；

（2）利用锡纸包裹载玻片并使操作面锡纸平滑光整，另一面防水胶布固定收紧。

6.根据权利要求2所述的一种超薄型Ⅰ/Ⅱ型胶原复合支架的制备方法，其特征在于，所述I/II型胶原复合支架制备方法如下：

（1）取少量I型胶原凝胶均匀涂于覆盖锡纸的载玻片上，取与I型胶原凝胶相同体积的II型胶原凝胶均匀涂于盖玻片上，将II胶原压在I型胶原上，盖玻片的四角均匀稍加力度使之均匀齐平载玻片，逐级冰冻，取出后迅速经真空冻干机冻干，即得未交联I/II型双层胶原支架；

（2）将支架置于交联混合液中交联，放入立式恒温振荡器中震荡24h，随后置于37℃恒温箱中24h，取出后超纯水冲洗多次，逐级冰冻后，真空冻干即得交联后的I/II型双层胶原支架。

7.根据权利要求6所述的一种超薄型Ⅰ/Ⅱ型胶原复合支架的制备方法，其特征在于：所述交联混合液由0.033mol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）、0.02mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸（MES）溶于75%的乙醇溶液中制得。