[发明专利]一种基于G四链体分子信标双酶级联等温扩增的检测目的miRNA的方法

权利要求书

1.一种检测目的miRNA的方法，包括如下步骤：

(1)取含有miRNA、反应缓冲液、DNA聚合酶、核酸外切酶和G4MB的反应体系，孵育；

(2)完成步骤(1)后，检测荧光强度；

根据荧光强度判断miRNA中是否含有目的miRNA或目的miRNA的含量；

G4MB从5’末端至3’末端依次包括DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3；

DNA片段1由1个5’端磷酸化并修饰荧光基团的dT和富G序列1组成；富G序列1为GGGACGGG；

DNA片段2的核苷酸序列与miRNA的核苷酸序列反向互补；

DNA片段3由1个3’端修饰淬灭基团的dA和富G序列2组成；富G序列2为GTGGAGGG；

DNA片段1和DNA片段3由于都存在富G序列在分子内形成绑定的G四链体结构；

所述DNA聚合酶作用于与G4MB的3’末端结合的引物，将引物进行延伸，形成双链DNA；

所述核酸外切酶作用于双链DNA，逐步切去单核苷酸，且不能从DNA的切刻或缺口处起始消化；

G4MB的5’端具有磷酸基团，3’端具有引物结合位置，且以打开的G4MB为模板，通过引物和DNA聚合酶引发合成双链杂合结构；

所述DNA聚合酶为Bsu DNA聚合酶；

所述核酸外切酶为Lambda核酸外切酶；

所述方法用于非疾病的诊断与治疗。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应体系还含有核糖核酸酶抑制剂。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述反应缓冲液为含40-60mM NaCl、15-25mM MgCl₂、15-25mM KCl、130-170mM NH₄Cl和0.8-1.2mM DDT的pH7.8-8.0、15-25mM Tris-HCl缓冲液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，孵育为35-39℃孵育20min-3h。

5.如权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于：当检测N个目的miRNA时，需要加入N个G4MB且各个G4MB的荧光标记完全不同；N为1以上的自然数。

6.DNA聚合酶、核酸外切酶、G4MB和反应缓冲液在检测目的miRNA中的应用；

G4MB从5’末端至3’末端依次包括DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3；

DNA片段1由1个5’端磷酸化并修饰荧光基团的dT和富G序列1组成；富G序列1为GGGACGGG；

DNA片段2的核苷酸序列与miRNA的核苷酸序列反向互补；

DNA片段3由1个3’端修饰淬灭基团的dA和富G序列2组成；富G序列2为GTGGAGGG；

DNA片段1和DNA片段3由于都存在富G序列在分子内形成绑定的G四链体结构；

所述反应缓冲液为含40-60mM NaCl、15-25mM MgCl₂、15-25mM KCl、130-170mM NH₄Cl和0.8-1.2mM DDT的pH7.8-8.0、15-25mM Tris-HCl缓冲液；

G4MB的5’端具有磷酸基团，3’端具有引物结合位置，且以打开的G4MB为模板，通过引物和DNA聚合酶引发合成双链杂合结构；

所述DNA聚合酶为Bsu DNA聚合酶；

所述核酸外切酶为Lambda核酸外切酶；

所述应用用于非疾病的诊断与治疗。