[发明专利]一种α-L-岩藻糖苷酶的制备方法

说明书

本发明公开了一种α‑L‑岩藻糖苷酶的制备方法。其特征为如下(a)或(b)或(c)或(d)：(a)其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，且具有α‑L‑岩藻糖苷酶的活性(EC 3.2.1.51)；(b)其氨基酸序列与(a)有70％及以上的同源性；(c)其核酸序列为SEQ ID NO：2或编码的氨基酸序列为(a)的核酸序列；(d)其核酸序列编码的氨基酸序列与(a)有70％及以上的同源性。本发明采用大肠杆菌表达系统，经过表达条件和纯化条件的优化，以最短的生产周期，获得低成本、高纯度、高产量、高稳定性和重复性的活性α‑L‑岩藻糖苷酶，具有非常广阔的市场应用前景。

技术领域

本发明涉及分子生物学、生物化学、基因工程领域，具体涉及一种α-L-岩藻糖苷酶的制备方法。

背景技术

生物体内的很多蛋白质和脂类都有糖基化修饰，这些用作修饰的寡聚糖不仅参与调控被修饰的蛋白质和脂类的结构稳定性，而且参与调控细胞内的各项功能和细胞间的相互作用。糖苷水解酶(EC3.2.1)是一类能够水解糖苷键的酶，能够对这些寡聚糖进行剪切和修饰，从而改变它们的调控作用。根据底物特异性不同，糖苷水解酶可分为195种(EC3.2.1.1-EC3.2.1.195)。α-L-岩藻糖苷酶已经从很多微生物、植物、软体动物以及哺乳动物中提取出来。根据功能不同，可分为α-L-岩藻糖苷水解酶(EC3.2.1.51)和α-L-岩藻糖基转移酶[α-(1→2)(EC 3.2.1.63)，α-(1→3,4)(EC 3.2.1.111)，α-(1→6)(EC3.2.1.127)]。根据氨基酸序列相似性不同，在碳水化合物-活性酶(Carbohydrate-ActiveEnzymes,CAZy)数据库中，可分为GH29和GH95两个家族。

AFU是一种溶酶体酶，广泛存在于人体组织细胞、血液和体液中，参与糖蛋白、糖脂和寡糖的代谢。AFU严重缺陷时，会出现岩藻糖苷沉积症，造成智力和运动迟缓。目前已知的有几种病理情况也与AFU的活性异常相关，包括炎症、癌症、囊肿性纤维化等(Expression,Purification and Characterization of Humanα-L-Fucosidase.ShenWen Liu,YawKuenLi)。AFU活性检测具有非常广泛的临床意义。血清AFU活性升高可区别继发性肝癌、支持特异性诊断原发性肝癌(Serumα-L-fucosidase:a new marker for the diagnosis ofprimary hepatic carcinoma？Yves Deugnier etc.)。AFU与甲胎蛋白(α-Fetoprotein，AFP)联合检测，对原发性肝癌的诊断具有很高的敏感性和特异性(AFU、AFP及CEA对原发性肝癌的诊断意义，潘源等)。与AFP相比，AFU原发性肝癌具有较高的早期诊断价值(DEN诱发SD大鼠原发性肝癌形成过程中AFU价值的研究，何谦等)。大多数肝硬化和一部分乙肝患者的血清AFU活性均有不同程度的升高，血清AFU活性测定有助于乙肝病情发展的预测及肝硬化患者预后的观察(血清α-L-岩藻糖苷酶活性与乙型肝炎相关性研究，张明珠等)。急性白血病患者血清AFU活性高于健康对照组，升高的血清AFU可能来源于单核细胞系统(急性白血病患者血清α-L-岩藻糖苷酶的变化，吴霜等)。卵巢癌AFU活性明显低于正常人，AFU也可做为卵巢癌患者的一项特异性诊断指标(卵巢癌患者AFU活性明显低于正常人，AFU也可做为卵巢癌的一项特异性诊断指标(血清α-L-岩藻糖苷酶的测定及临床意义，荆洁线等)。正常妊娠妇女血清AFU活性水平随孕周增加而升高，在自然分娩或人工终止妊娠后迅速下降，5天后降至正常，可用于临床监测孕期进展情况(正常妊娠妇女不同孕周血清ALP、AFU的变化及临床意义，胡海岩等)。糖尿病患者血清AFU水平明显高于正常对照组，血糖控制差的糖尿病患者其AFU酶活力与同时测定的空腹血糖和糖化血红蛋白存在着显著正相关，而血糖控制好的糖尿病患者组AFU酶活力与正常对照组无显著性差异且与空腹血糖和糖化血红蛋白不相关，说明糖尿病患者AFU水平与糖代谢控制的程度有关(糖尿病患者血清α-L-岩藻糖苷酶测定的临床意义，周永列等)。恶性腹水组AFU活性明显高于良性腹水组，表明腹水AFU活性测定对良恶性腹水有较高的鉴别诊断价值(AFU对良恶性腹水的鉴别诊断，张弘等)。临床诊断明确的肺部疾病患者中，肺癌组、肺结核组和肺心病组血清AFU活性均高于正常组，而慢阻肺组AFU活性低于正常组，说明AFU与肺部疾病的发生、发展有密切关系，对鉴别诊断具有一定的临床价值(肺部疾病患者血清唾液酸和岩藻糖苷酶测定及临床意义，杨国辉等)。