[发明专利]一种细胞复合型子宫内膜修复凝胶的制备方法及应用

权利要求书

1.一种细胞复合型子宫内膜修复凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、子宫内膜干细胞的提取与培养，得到子宫内膜干细胞；

步骤二、间充质干细胞的提取与培养，得到间充质干细胞；

步骤三、温敏性壳聚糖水凝胶的制备；

步骤四、细胞复合型子宫内膜修复凝胶的制备。

2.如权利要求1所述的一种细胞复合型子宫内膜修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤一包括以下步骤：

(1)、无菌条件下，取子宫内膜组织，用无Ca²⁺和Mg²⁺的PBS缓冲液冲洗至少三次，然后转入无菌培养皿中，并将其剪至体积小于1mm³的小块；

(2)、向步骤(1)的无菌培养皿中加入1.5～3倍体积的0.1v/v％胶原酶水溶液，在37℃下，水浴振荡消化30～80min，收集消化液于离心管中，向离心管中加入DMEM/F12完全培养基终止消化，然后1000rpm离心10min，弃去上清，保留细胞沉淀；

(3)、向离心管中加4～8倍体积的红细胞裂解液，持续震荡，直到离心管内液体逐渐变为红色时，向离心管中添加10ml PBS缓冲液，再次1000rpm离心5min，弃上清，保留细胞沉淀；

(4)、用PBS缓冲液洗涤上述细胞沉淀沉淀至少2次，弃上清，保留细胞沉淀；

(5)、用4倍体积的DMEM/F12完全培养基重悬步骤(4)保留的细胞沉淀，制备细胞悬液；

(6)、将细胞悬液依次过200目及400目网筛并用DMEM/F12完全培养基冲洗细胞网，收集400目下的细胞悬液，以1000rpm离心5min，弃上清，保留细胞沉淀；

(7)、向步骤(6)保留的细胞沉淀中加入DMEM/F12完全培养基重悬上述细胞沉淀，并转移到细胞培养瓶中，在37℃、5v/v％CO₂培养箱中进行培养，于培养24～48h后首次用DMEM/F12完全培养基进行半量换液，以后每2-3天用DMEM/F12完全培养基进行一次全量换液，弃去未贴壁细胞，待原代细胞生长融合达80％-90％时，加入含0.02％EDTA的0.25％的胰酶水溶液进行传代，并以6×10³个细胞/cm²的密度进行传代培养,传到三代及三代以上,得到子宫内膜干细胞，其中：

步骤(2)、步骤(5)、步骤(6)、步骤(7)中的DMEM/F12完全培养基含10v/v％FBS和1v/v％青链霉素，余量为DMEM/F12。