[发明专利]葡萄糖抑制效应解除的酵母菌及其利用非葡萄糖碳源的方法

说明书

本发明涉及一种马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces.marxianus)CGMCC No.20304，该菌株中的葡萄糖抑制效应解除，对木糖、甘油、蔗糖、棉籽糖、乳糖等非葡萄糖碳源的能力不再受2‑脱氧葡萄糖的抑制，且保持了葡萄糖的利用能力，特别是该菌株利用木糖的能力较高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种葡萄糖抑制效应解除的酵母菌及其利用非葡萄糖碳源的方法，尤其是耐热酵母菌株马克斯克鲁维酵母的突变株，该突变株中的葡萄糖抑制效应解除，且保持了葡萄糖的利用能力，利用非葡萄糖碳源如木糖、甘油、半乳糖、蔗糖、棉籽糖，特别是木糖的能力高。

背景技术

木质纤维素生物质类生物质，例如玉米秸秆、玉米芯、柳条稷、芒草等的主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素(Fatma et al.,2018)，其水解得到的主要单糖包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖极少量的果糖和乳糖。而其他的乳制品行业废液、淀粉产业的废渣、废渣处理液等也包含葡萄糖之外的糖类。这些糖类的完全利用对生物基的化学产品的经济性非常重要(Kim et al.,2012)。

葡萄糖抑制效应，又称葡萄糖阻遏或分解代谢产生阻遏作用，指葡萄糖或某些容易利用的碳源其分解代谢产物阻遏某些编码诱导酶体系的基因的转录的现象。其在微生物中的存在严重抑制了微生物对生物质水解液中非葡萄糖碳源的利用，也显著降低了目标产物的得率和速率，从而使生产经济性下降(Kim et al.,2012)。为了高效利用木质纤维素材料和各种生物质相关的废料，需要实现混合糖的共利用。

因此，需要一种解除了葡萄糖抑制效应，既，在混合糖中能够利用非葡萄糖碳源，且非葡萄糖碳源利用能力高的微生物。

对于解除葡萄糖抑制效应而言，申请人在以前的研究中发现，在酵母菌中己糖激酶基因的敲除可以解除葡萄糖效应(Hua et al.,2019)，但是该策略会使菌株利用葡萄糖的能力迅速下降，同时丧失果糖利用能力。即使在其中通过过表达葡萄糖激酶基因而改善了葡萄糖利用效率，该菌株依然丧失了果糖的利用能力，难以作为良好的平台菌株应用。

SNF3(sucrose non-fermening 3,SNF3)为细胞膜低葡萄糖感受器，是诱导己糖运输的高亲和力感受器，同时，SNF3还能够感应果糖和甘露糖，具有一个同源蛋白RGT2。在酿酒酵母中，SNF3是一个与糖转运蛋白高度同源的葡萄糖感受器，SNF3和RGT2分别感受低浓度和高浓度的葡萄糖(Ozcan et al.,1996)。

如果酿酒酵母中的SNF3和RGT2被敲除则该菌株利用葡萄糖的显著能力下降，利用葡萄糖的生长变得非常缓慢(Ozcan,2002)。单独敲除酿酒酵母中SNF3会导致该菌株丧失利用蔗糖和棉籽糖生长的能力，同时丧失利用低浓度葡萄糖的能力(Neigeborn et al.,1986)。对蔗糖利用的关键基因SUC2和利用半乳糖的关键基因的beta-半乳糖苷酶的表达分析发现，酿酒酵母的SNF3的敲除并不改变葡萄糖对蔗糖和半乳糖利用基因表达的抑制，其中蔗糖利用能力的丧失可能是由于蔗糖吸收能力的丧失导致的。因此，仍然没有得到解除了葡萄糖抑制效应的微生物，更谈不上在此基础上非葡萄糖碳源利用能力高的菌株。

耐热的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces.marxianus)作为公认的安全微生物(GRAS)，用于发酵时有以下几个优点：1、安全，可以用于食品工业；2、高温发酵，这一般会使得发酵速率更快，且在发酵工艺上减少了冷却成本，同时减少了污染的风险(Zhang etal.,2016)；3、底物谱很广泛，可利用葡萄糖、木糖、半乳糖、菊糖等等(Pentjuss et al.,2017)；4、本身可产生多种酶，如果胶酶，β-D-半乳糖苷酶和菊糖酶等，使得它可以直接利用多种原料(Fonseca et al.,2008)。在以木质纤维素生物质及乳制品废液等为底物生产化学品时，马克斯克鲁维酵母具有更明显的优势，所以利用马克斯克鲁维酵母发展成乳酸生产菌株具有非常重要的应用价值。