[发明专利]一种带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系、构建方法、鉴定方法及应用

说明书

本发明属于多能干细胞领域，具体涉及一种带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系、构建方法、鉴定方法及应用。本专利利用基因编辑方式将Cas9基因整合到人源iPS细胞基因组中，从而构建可以进行基因编辑的人源iPS细胞系（iPS‑Cas9）。基于该iPS‑Cas9细胞系，后续可以构建任何类型的基因突变iPS细胞，进而诱导其分化为特定的靶细胞，建立疾病细胞模型，进行疾病发病机理和药物筛选研究等，具有巨大的临床应用价值。

技术领域

本发明属于多能干细胞领域，具体涉及一种带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系、构建方法、鉴定方法及应用。

背景技术

2006年，Yamanaka等首次通过逆转录病毒将四种重编程因子（Oct4, Klf4, Sox2,和c-Myc）导入到小鼠皮肤成纤维细胞, 进而获得了类似于胚胎干细胞（ES）的全能干细胞,并命名为“可诱导多能性干细胞”（iPS）。紧接着，Takahashi等和Yu等又分别将人源成纤维细胞重编程为iPS细胞，使得iPS细胞用于临床的可能性又向前迈进了一步。iPS细胞既具备了ES细胞一样的多能性，理论上能被诱导分化为各种类型的细胞，同时彻底规避了ES细胞所面临的免疫排斥和伦理学问题，具备巨大的临床应用价值。iPS细胞主要用于细胞分化和移植，并可提供体外的疾病模型，以便于研究疾病形成的机制、筛选新药以及开放新的治疗方法，如何使iPS细胞具有更大的应用价值是目前需研究的方向。

发明内容

本发明的第一方面，提供一种带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系。CRISPR/Cas9技术是目前最具价值的基因编辑技术，它可以利用特定的sgRNA引导Cas9酶对靶基因进行切割，造成DNA双链断裂。从而利用基因同源重组或非同源重组，在特定的靶基因序列区进行基因编辑，引入突变，纠正突变或插入特定外源基因序列。本发明提供的iPS-Cas9细胞系，后续可以构建任何类型的基因突变iPS细胞，进而诱导其分化为特定的靶细胞，建立疾病细胞模型，进行疾病发病机理和药物筛选研究等，具有巨大的临床应用价值。

本发明的第二方面，提供如上述的述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系的构建方法，包括以下步骤：

（1）将能靶向人源iPS细胞AAVS1安全位点区的gRNA序列克隆至带有gRNA克隆位点和Cas9酶基因序列的载体上，得到克隆载体；

（2）将步骤（1）得到的克隆载体和带有药物筛选标记和Cas9酶的基因序列的载体共转入人源iPS细胞中；

（3）通过外加药物进行筛选，获取带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞；

步骤（2）中的药物筛选标记与步骤（3）中外加的药物相对应。

优选地，步骤（1）中，能靶向人源iPS细胞AAVS1安全位点区的gRNA序列为: 5'-CACCGGTCCCCTCCACCCCACAGTG-3' 和3'-CCAGGGGAGGTGGGGTGTCACCAAA-5'。

优选地，步骤（1）中，用BbsI酶切带有gRNA克隆位点和Cas9酶基因序列的载体，然后与带BbsI酶切位点的且能靶向人源iPS细胞AAVS1安全位点区的gRNA序列行T4 DNA 连接酶连接，连接产物纯化后即为克隆载体。

优选地，步骤（2）中，通过细胞电转仪将步骤（1）得到的克隆载体和带有药物筛选标记和Cas9酶的基因序列的载体共转入人源iPS细胞中。

优选地，所述步骤（2）中的药物筛选标记为嘌呤霉素药物筛选标记，步骤（3）中外加的药物为嘌呤霉素。

优选地，步骤（3）中，将步骤（2）得到的iPS细胞用带嘌呤霉素的培养基培养，筛选出将带有嘌呤霉素抗药性的iPS细胞即为带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞。