[发明专利]凝血酶的亲和色谱柱、制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种凝血酶的亲和色谱柱。该凝血酶的亲和色谱柱填料为琼脂糖‑凝血酶偶联复合物，琼脂糖‑凝血酶偶联复合物通过湿法装柱获得亲和色谱柱。凝血酶的亲和色谱柱的制备方法，将购买的凝血酶冻干粉溶解后除去冻干保护剂；取CNBr活化的琼脂糖凝胶Focurose 4FF用水洗涤；偶联得到琼脂糖‑凝血酶偶联复合物；封闭所有残留的活性基团；除去未偶联上的多余的配体；凝血酶去活处理，轻柔震荡后使用纯水冲洗，制得凝血酶亲和填料；采用湿法装柱，冰箱4℃保存。本发明以凝血酶为原料与CNBr活化的琼脂糖凝胶Focurose 4FF偶联制备凝血酶亲和色谱柱。此偶联反应简单易控，反应条件温和，操作方便，同时可重复性高，易于工业放大。另外本发明的亲和柱可重复使用多次。

技术领域

本发明涉及亲和色谱柱，尤其是涉及凝血酶的亲和色谱柱，以及凝血酶的亲和色谱柱制备方法。

背景技术

凝血酶是一种存在于血液中的酶蛋白，在血浆中以凝血酶原的形式存在。凝血酶通过对多种血液蛋白质的水解作用参与凝血过程。作为一种丝氨酸类蛋白水解酶,凝血酶在参与凝血作用的同时,对底物还具有高度的特异性,可以专一性地切割X-Arg-g ly或Gly-Arg-X序列中由精氨酸(Arg)羧基参与形成的肽键。由于这种高度特异性,使凝血酶具有了可以作为工具酶来加工目的产物的潜力。此外,凝血酶还具有多种其他功能,如诱导血小板活化,刺激成纤维细胞分化等。

亲和色谱是利用生物分子间专一的亲和力进行分离的色谱技术，如酶与底物及抑制剂、抗体与抗原、激素与受体之间存在特异性亲和作用力，将其中之一作为配基制备固定相，用于色谱分离或者分子间相互作用研究。常见的亲和色谱类型有生物亲和色谱、免疫亲和色谱、固定化金属离子亲和色谱等。亲和色谱技术由于特异性强、纯化步骤简单等被广泛应用于抗原、抗体、抑制剂等的分离纯化。

以凝血酶为配基进行亲和色谱，可以用于凝血酶直接抑制剂的筛选。文献曾报道将凝血酶偶联琼脂糖凝胶作为亲和色谱介质用于水蛭抗凝活性成分的筛选，经过凝血酶亲和色谱介质纯化后的产品抗凝血酶活性可以达到7700U/mg。然而偶联条件如反应时间、pH、凝血酶的用量、偶联后的亲和色谱介质稳定性等却未见报道。事实上，在进行偶联时配基的用量、偶联的反应条件等将对亲和色谱介质的性质产生重要影响，不恰当的偶联方法可能引起偶联量、偶联位点、偶联取向不合适或产生空间位阻等现象。因此有必要对偶联条件进行控制。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供容易制得的凝血酶的亲和色谱柱，以及偶联反应简单易控，反应条件温和，操作方便的凝血酶的亲和色谱柱制备方法。

为实现上述目的，本发明凝血酶的亲和色谱柱采用的技术方案是：

一种凝血酶的亲和色谱柱，填料为琼脂糖-凝血酶偶联复合物，琼脂糖-凝血酶偶联复合物通过湿法装柱获得亲和色谱柱。

本发明凝血酶的亲和色谱柱制备方法采用的技术方案是：

凝血酶的亲和色谱柱的制备方法，采用如下步骤：

(1)凝血酶准备，将购买的凝血酶冻干粉溶解后除去冻干保护剂；

(2)基质准备，取CNBr活化的琼脂糖凝胶Focurose 4FF用水洗涤；

(3)偶联，使用偶联缓冲液冲液溶涨CNBr活化的琼脂糖凝胶Focurose4FF，迅速将琼脂糖凝胶Focurose 4FF转移到含有凝血酶的偶联缓冲液中，得到琼脂糖-凝血酶偶联复合物；

(4)封闭活性基团，步骤(3)所得琼脂糖-凝血酶偶联复合物转入含有甘氨酸的偶联缓冲液中，封闭所有残留的活性基团；

(5)洗涤，依次用含有NaCl的醋酸-醋酸钠缓冲液和含有NaCl的Tris-HCl缓冲液分别洗涤步骤(4)所得琼脂糖-凝血酶偶联复合物，除去偶联后未偶联上的多余的配体；