[发明专利]一种芯片上恒温扩增测序的方法

说明书

本申请公开了一种芯片上恒温扩增测序的方法。将修饰了两种扩增引物的微球首先固载到基因测序芯片上，然后在芯片内进行恒温扩增反应，从而应用于基因测序。本发明所述的方法效率比较高，不需要特殊的仪器，不需要复杂的建库流程，并且可以和现有的测序方法兼容，特别的也适合于荧光切换的测序方法。

技术领域

本发明涉及一种芯片上恒温扩增测序的方法，属于基因测序领域。

背景技术

高通量测序技术是目前生命科学领域常见的分析技术之一，该技术可以将DNA样本片段进行测序，得到对应样本的DNA序列，建立生物表型与基因组、转录组等层面上的联系。现在，第二代测序技术因为其巨大的通量和相对廉价的价格，已经占据了测序领域的绝大部分市场。第二代测序技术的一大特点就是不是对单独的一条DNA进行测序，而是将一条DNA进行扩增几千几万倍后再进行测序和信号采集，而这其中就要用到不同的DNA扩增技术。目前当今世界上的主流测序技术都有着自己对应的特有的扩增技术。Illumina公司可逆末端终止测序技术使用了桥式扩增方法：在平面芯片表面种植两种不同引物后进行桥式PCR并得到DNA簇；ion torrent公司的半导体测序方法对应的是乳液PCR的扩增方法：在形成的乳液内的微球上进行固相PCR，之后再固载到芯片上；华大测序仪则是使用的DNA纳米球的扩增方式：将DNA固载到芯片表面后扩增成一团DNA纳米球。但是这些方法要么直接与现有的荧光发生测序方法不兼容，要么需要特殊且复杂的文库构建过程，要么需要额外的复杂仪器单独进行扩增。

本发明阐述了一种基于固载了两种引物微球的、在芯片上发生的的恒温扩增方法。将预先修饰好的微球通过固载基团固载到芯片上，然后通入试剂，经过杂交，恒温扩增的步骤就可以进行测序反应。本发明提供一种高通量基因测序反应的恒温扩增的微球准备方法，不需要复杂的仪器，特殊的设备，并且和已知的大部分测序反应可以兼容，特别的可以应用于荧光发生或者成为荧光切换的测序反应。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种通过芯片上恒温扩增测序的方法，在将微球固载到芯片上，原位的发生杂交、扩增反应，并且应用于测序的方法。

为实现上述目的，本发明采取下述方案：

一种芯片上恒温扩增测序的方法，其特征在于包括以下步骤，

(1)将微球固载到基因测序芯片的表面

所述的微球表面预先连接了两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物，并且至少一种扩增引物的序列上含有可被剪切的位点；

所述微球的表面还预先修饰了固载用的基团,利用固载基团将微球固载到基因测序芯片的表面；

(2)杂交，延伸，解旋，清洗

将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；

加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；所述含有DNA聚合酶的反应液中含有dNTP；

解旋，并且清洗解旋下的扩增模板片段，得到微球表面带有与扩增模板互补配对的DNA链；

(3)恒温扩增

加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增；

加入剪切试剂，将扩增后的双链模板剪切为单链；

加入封端试剂，将微球表面的DNA链的3’端进行封堵；

(4)测序

杂交测序引物，测序。