[发明专利]碱性磷酸酶的下游处理

说明书

本发明涉及碱性磷酸酶(AP)的下游处理(DSP)领域。更具体地，本发明涉及减少包含AP的组合物中宿主细胞蛋白含量的方法。本发明进一步涉及包含AP和减少含量的宿主细胞蛋白的组合物。

分案说明

本申请为申请日为2015年1月26日，申请号为201580015952.3，题目为“碱性磷酸酶的下游处理”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及碱性磷酸酶(AP)的下游处理(DSP)领域。更具体地，本发明涉及用于降低包含AP的组合物中宿主细胞蛋白含量的方法。本发明进一步涉及包含AP和降低含量的宿主细胞蛋白的组合物。

背景技术

碱性磷酸酶(AP)

AP；根据IUBMB酶命名法EC 3.1.3.1，常用名为碱性磷酸酶(AP)是一种将磷酸酶单酯和H₂O催化成为醇和磷酸盐的反应的酶。AP的其他名称为碱性磷酸单酯酶；磷酸单酯酶；甘油磷酸酶；碱性磷酸水解酶；碱性苯基磷酸酶；正磷酸单酯磷酸水解酶(碱性最佳)。AP的系统命名为磷酸单酯磷酸水解酶(碱性最佳)。

AP是一种广谱特异性酶，其也催化转磷酸作用。在人类和其他哺乳动物中，已知存在至少四种不同的，但相关的碱性磷酸酶。其为肠(ALPI)、胎盘(ALPP；仅在人和灵长目动物中)、胎盘样(GCAP)和肝/骨/肾(或组织非特异性)碱性磷酸酶(TNAP)。前三种一起位于染色体2上，而组织非特异性形式位于染色体1上。

碱性磷酸酶的氨基酸序列以及催化结构域和冠状结构域的相对位置是本领域技术人员公知的。例如，可参照Millán的关于哺乳动物碱性磷酸酶的教科书(MammalianAlkaline Phosphatases,Wiley-VCH(2006),ISBN-13：978-3-527-31079-1)，其中示出了四种人碱性磷酸酶的氨基酸序列等。

用于药物用途的AP

之前已经显示AP作为许多疾病的药物是有益的(急性肾损伤(AKI)、败血症、炎性肠病(IBD)等)。这些研究使用天然存在的AP，例如分离的牛AP以及分离和重组人AP。在一些动物模型中，已经使用了重组嵌合的碱性磷酸酶，其包括人肠AP的催化结构域和人胎盘AP的冠状结构域(描述在WO2008133511中)。目前，包含具有图18中所示序列(SEQ ID NO：1)的新型和改善的重组嵌合的碱性磷酸酶的药物组合物正在被开发用作药物。

在药物组合物的开发过程中，使用蛋白质并且尤其是AP的标准(DSP)方法，例如亲和色谱(Mimetic Blue)、阴离子交换色谱(Poros 50)以及混合模式色谱(Capto-)。在优化DSP步骤之后并且药物组合物符合之前监管当局设定和要求的规格之后，制备用于临床批次生产的制剂。然而，在最后阶段稳定性测试期间，观察到了颗粒形成。

这是一个无法预见的问题，而由于颗粒形成是药物组合物中有害的方面，必须找到解决方案。

不清楚颗粒的性质如何，并且通过离心收集颗粒和分析之后，在银染色的非还原性SDS-PAGE凝胶中富集了非AP条带。该条带的酶促消化的质谱分析揭示了存在宿主细胞蛋白(HCP)而不是AP。这是尤其不可预见的，因为根据之前对宿主细胞蛋白进行的测试，组合物中如此少量的HCP(100ppm)无法解释相对大量的颗粒。

宿主细胞蛋白(HCP)