[发明专利]一种基于G4-血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的方法

说明书

本发明公开一种基于G4‑血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的方法，属于分子生物信息学领域；本发明将两组探针用于DNA酶杂交，并摸索合适的温度和pH反应条件，调节相关试剂浓度，提高了该酶的核酸检测灵敏度，同时使用Tritonx‑100和NH₄⁺作为该酶的活化剂可显著提高其检测灵敏度；此外，本发明发现底物ABTS²‑被催化后的绿色产物ABTS·‑颜色快速褪色的原因是由于H₂O₂使ABTS·‑歧化，而不是H₂O₂降解血红素，而Tris‑NH₄Cl缓冲液被证实可以除去催化显色反应后残留的H₂O₂，避免H₂O₂清除绿色产物ABTS·‑，从而使绿色产物稳定存在，进而使检测结果能维持三天以上。

技术领域

本发明涉及分子生物信息学领域，特别是涉及一种基于G4-血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的方法。

背景技术

核酸检测通常是在将微量的靶核酸扩增到可检测水平后，通过固相或液相杂交进行。然而，固相杂交反应有许多缺点，特别是洗涤步骤较多、杂交过程耗时等原因，限制了其在核酸诊断的应用。因此仍然需要开发简单、快速、低成本和可靠的核酸检测方法。

G-四链体/血红素DNAzyme因其成本低、操作简便、杂交速度快、可肉眼观察检测结果等优点，在核酸检测中受到广泛关注。它表现出类似过氧化物酶的活性，因此能够在H₂O₂存在下催化无色的2,2′-叠氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS^2-)氧化为绿色自由基ABTS·^-。此外，通过将G-四链体序列分成两部分，得到的分裂G-四链体与血红素结合，仍能形成保留原始催化活性的DNA酶。这一特性使其适合于核酸液相杂交。该酶已用于肿瘤突变p53基因、猪瘟病毒RNA和致病性结核分枝杆菌DNA的核酸检测。

事实上，G4DNA酶本质上仍然是一种简单的酶。在过去的20多年中，关于G4DNA酶的研究很多，但迄今为止还没有G4DNA酶的商业化产品用于核酸检测。目前其存在的两个主要问题是相对较低的催化活性、与底物ABTS^2-催化作用后显色时间较短。影响G4DNA酶性能的因素很多，如G4DNA酶形成序列及其结构、反应溶液组成、底物等。很多研究致力于解决上述两个问题，但到目前为止，还没有解决这些问题的系统性报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于G4/血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的方法，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供Tris-NH₄Cl在延长探针G4/血红素DNA酶系统中催化产物显色时间的应用。

本发明还提供一种基于G4-血红素DNA酶系统检测单链靶核酸序列的系统，包括：缓冲液A；所述缓冲液A包括Tris和NH₄Cl。

进一步的，所述缓冲液A的具体成分为Tris、探针、Triton X-100、氯化血红素和NH₄Cl；所述缓冲液B的具体成分为ABTS二铵盐和H₂O₂。

进一步的，所述Tris的终浓度为50mM；所述NH₄Cl的终浓度为150mM；0.0003％Triton X-100；所述探针的终浓度为400nM；所述hemin的终浓度为500nM；所述ABTS^2-的终浓度为6mM；所述H₂O₂的终浓度为2mM。

进一步的，所述Tris的pH为7.5-9.0。

进一步的，所述Tris的pH为8.0。