[发明专利]用于宫颈高级别病变和宫颈癌早期检测的组合物及试剂盒

说明书

本发明公开了用于宫颈高级别病变和宫颈癌早期检测的组合物及试剂盒，用于宫颈高级别病变和宫颈癌早期检测的组合物，包括FAM19A4基因甲基化引物、甲基化位点对应的探针和甲基化封闭引物，JAM3基因甲基化引物、甲基化位点对应的探针和甲基化封闭引物，PAX1基因甲基化引物、甲基化位点对应的探针和甲基化封闭引物，内参基因GAPDH的1对引物和甲基化位点对应的探针。采用多重多通道荧光和封闭技术手段，通过特异性引物探针与甲基化序列准确识别，加上多条封闭引物的作用将甲基化模板充分释放出来，以及优化的特殊的甲基化DNA聚合酶，对FAM19A4、JAM3和PAX1基因甲基化位点精确检测。

技术领域

本发明属于核酸体外诊断的技术领域，具体涉及一种将特定的基因甲基化标志物应用于宫颈高级别病变和宫颈癌早期检测的组合物及试剂盒。

背景技术

目前，宫颈癌是世界女性第四大易发癌种，据统计，2018年全球宫颈癌新发病例570,000例，死亡311,000例，宫颈癌成为多数中低收入国家女性癌症死亡的主要原因。宫颈癌病因明确，高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持续感染是必要条件，由宫颈癌前病变发展至浸润性宫颈癌的过程可长达十年，因而早期进行宫颈癌筛查可以有效阻断癌前病变的进展。近几年宫颈癌的发病趋势愈发年轻化，小于35岁女性发病率明显上升，约占新发病例的30％，另有数据显示，宫颈癌的发病率存在地理差异，农村居民的发病率高于城市居民，我国中部地区较东、西部发病率高，这些差异可能部分归因于缺乏对宫颈癌的有效筛查及防治措施。近年来，随着基因检测和基因编辑技术的发展、预防性HPV疫苗的推广以及治疗性疫苗的开发研究，为宫颈癌早期筛查及预防指明了新的方向。

人乳头瘤病毒(HPV，全称为human papillomavirus)被认为是宫颈癌发生最主要原因，其和宫颈癌的关系最先于在上世纪70年代的时候由德国的科学家Harald zurHausen提出的，而后得到了验证。据研究，HPV有多达100多种亚型，目前通常根据它的致癌性与否分为低危型和高危型：低危型的HPV通常不会导致恶性病变，但是高危型的HPV感染可能会最终导致宫颈癌前病变和宫颈癌，例如，最主要的两种高危型HPV病毒HPV-16和HPV-18基本跟90％以上的宫颈癌相关。在通常情况下，绝大多数的HPV感染都是暂时的，约超过90％以上的感染会在2～3年里清除掉，而这被认为要归因于人类的细胞调节免疫系统。但值得注意的是，在感染后对HPV-16病毒的抗体似乎只能起到相对普通的效果，没能够自发清除掉的患者在随后的数年或数10年中有发展成为宫颈上皮内瘤病变CIN(cervicalintraepithelial neoplasia)甚至宫颈癌的危险。

早期筛查是预防宫颈癌癌前病变及宫颈癌的一种有效方法，目前临床上常用的检测手段主要包括液基细胞学检测和HPV检测。相较于传统的巴氏涂片法(灵敏度在30～87％之间，有时灵敏度甚至低于20％)，液基细胞学检测具有一定的提升，但仍有一定比例的假阴性结果(有研究表明，假阴性概率约为50％)。由于持续性的高危型HPV感染是宫颈病变的首要原因，对HPV核苷酸的检测在对宫颈病变的检测上具有极高的灵敏度(文献数据约为90％)，但由于仅有小部分的高危HPV感染患者会表现出宫颈病变，因而HPV检测表现出极低的特异性(约为60.7％)，特别是在年轻女性中。

DNA甲基化是表观遗传学的一种修饰方式，研究报告，DNA甲基化能影响正常哺乳细胞的基因表达和沉默；同时，在人类肿瘤研究中发现，DNA甲基化通常能导致肿瘤抑制基因启动子区域的CpG岛变化。肿瘤抑制基因启动子区域的高甲基化或者低甲基化都可能导致细胞转化，而使DNA甲基化状态成为肿瘤检测的潜在标志物。