[发明专利]一种去除毕赤酵母表达重组蛋白聚集体和/或降解片段的方法

说明书

本公开提供一种去除毕赤酵母表达重组蛋白聚集体和/或降解片段的方法，具体提供对含有毕赤酵母表达重组蛋白的发酵液采用多模式色谱树脂进行纯化的方法，其中在发酵液样品上样步骤和洗脱步骤之间包括乙醇淋洗的步骤，所述乙醇淋洗的步骤能够减少纯化产物中重组蛋白降解片段和聚集体。在对于重组人血清白蛋白‑人粒细胞集落刺激因子融合蛋白毕赤酵母发酵液采用Capto MMC层析纯化的方法中，洗脱前采用5‑20%的乙醇淋洗能降低产物中降解片段和聚集体的含量。与浓度为5%的乙醇相比，采用10‑20%的乙醇对降解和聚集体的去除效果有显著提高。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种毕赤酵母重组表达蛋白纯化方法，特别是涉及去除毕赤酵母重组表达蛋白聚集体和/或降解片段的方法，以及所述方法在纯化毕赤酵母重组表达蛋白、制备毕赤酵母重组表达蛋白单体、和/或提高毕赤酵母重组表达蛋白单体比例中的应用。

背景技术

人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，是一种来源于单核细胞和纤维组织母细胞的长链多肽糖蛋白，可诱导造血干细胞的增值和分化，促进血液中的中性粒细胞数增加；另外还具有刺激成熟中性粒细胞从骨髓中释放出并激活中性粒细胞的功能。自1991年起，重组人粒细胞集落刺激因子(rG-CSF)已经广泛用于治疗癌症化疗导致的骨髓抑制，可以显著改善化疗所引起的中性粒细胞减少症的严重性和持续时间。目前，已经有多种商业化rG-CSF制剂在销售，如非格司亭(filgrastim)(商品名为Gran^®和Neupogen^®)，雷诺司亭(lenograstim)(商品名为Neutrogin^®和Granocyte^®)，那曲司亭(nartograstim)(商品名为Neu-up^®)。但是，天然或重组的G-CSF由于分子量较小，极易被肾小球过滤，在人体内的循环半 衰期很短，只有2-4小时，每个化疗周期需要每天注射1-2次，持续注射5-7天(WelteK等，Proc Nat Acad Sci USA,82:1526-1530, 1985；FramptonJE等, Drugs, 48:731-760，1994)。延长G-CSF制剂体内半衰期可以减少给药次数。

人血清白蛋白(HSA)是血液循环中的一个非常重要的天然蛋白，在体液循环中可存在 20天以上。研究表明将治疗性蛋白基因与人血清白蛋白基因融合所表达的融合蛋白可明显 降低体内药物的清除速率，延长生物半衰期。通过基因工程方法将人白蛋白与G-CSF融合表达获得的rHSA/G-CSF,提高G-CSF在体内的半衰期(WendyHalpern等，Pharm Res,19:1720-1729，2002)；该融合蛋白结构中，人血清白蛋白位于N端，C末端可以直接与人粒细胞集落刺激因子的N端相连，也可以通过柔性的连接肽序列使两个蛋白相连。CN200910199337.9公开了G-CSF 融合蛋白突变体及其制备与应用，通过将人血清白蛋白的基因与人粒细胞集落刺激因子基因融合在一起，利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达获得了相应的融合蛋白。融合后形成的重组人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白克服了传统的人粒细胞集落刺激因子治疗过程中多次给药的缺点。此外，巴斯德毕赤酵母还具有高水平表达、成本低、以及具有真核表达系统的蛋白质加工、折叠、翻译后修饰等优点。

然而，与G-CSF相比，G-CSF/HSA融合蛋白分子较大，在重组表达、提取、纯化过程中容易被宿主蛋白酶降解产生无活性降解产物，并且重组G-CSF/HSA融合蛋白在宿主细胞中翻译后折叠、转运、分泌过程中易发生多聚化产生聚集体。降解产物、聚集体的存在不仅对G-CSF/HSA融合蛋白活性带来不期望的影响，而且由于其与G-CSF/HSA融合蛋白单体，序列结构、理化参数等方面高度相似，仅在长度、状态等方面存在差异，采用常规的蛋白质纯化手段往往难以达到理想的纯化效果。

发明内容