[发明专利]基于AAV载体的冠状病毒感染通用型基因治疗药物及制备方法

说明书

本发明涉及一种基于AAV载体的冠状病毒感染通用型基因治疗药物，其包括腺相关病毒，所述腺相关病毒具有AAV衣壳、包装在AAV衣壳中的ssAAV载体基因组、启动子、以及适于编码可溶性胞外区ACE2的序列；所述序列编码的蛋白质可分泌到胞外，且具有与S蛋白特异结合的功能域。本发明利用AAV载体将编码可溶性胞外区ACE2蛋白的基因序列导入靶细胞，使靶细胞分泌可溶性ACE2到细胞外以便与冠状病毒的S蛋白结合，达到拮抗SARS‑CoV感染的目的。所述基因序列是在编码ACE2全长蛋白(1‑805)基因序列的基础上通过删减获得的编码可溶性胞外区ACE2(1‑740)和(1‑620)非全长蛋白的基因片段，两种非全长蛋白均保留了与S蛋白特异结合的功能域，可分泌到胞外，用于抑制新冠病毒侵染。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种基于AAV载体的冠状病 毒感染通用型基因治疗药物。

背景技术

世界卫生组织将SARS-CoV-2引起的疾病正式命名为COVID-19 (coronavirusdisease-2019)。COVID-19感染者中约有25％表现为重症， 典型特征是严重的病毒性肺炎，极重型危及生命，粗病死率约在0.5％-1％。

SARS-CoV-2与SARS相似，具有相似的基因组构成和病毒结构特征， 二者都是通过Spike蛋白的RBD(receptor binding domain)识别和结合位 于靶细胞表面的ACE2(angiotensin-converting enzyme 2)受体，通过膜融 合，进入内体/溶酶体途径，脱衣壳，病毒基因组RNA释放，在细胞质中， 病毒的全长正链基因组先作为模板翻译少量RNA复制酶，接下来，无论 是完整基因组还是亚基因组(部分基因组区域)，都是先复制成负链RNA，再以负链RNA为模板，复制全长或亚基因组正链RNA，全长正链可包装 到新的病毒粒子中，每个亚基因组正链RNA都带有相同的5’非翻译区， 亚基因组正链RNA作为模板翻译病毒所需的酶和结构蛋白，用以形成病 毒粒子的壳。经复制包装的病毒粒子出芽到胞外，感染新的靶细胞，进入 下一个生活周期。Spike(S)蛋白是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，其含有两 个亚基S1和S2。其中S1主要包含有受体结合区(RBD)，负责识别细胞 的受体。S1区域可进一步分为N端和C端区域，RBD位于C端区域，是 与ACE2受体直接结合的结构域。人的ACE2基因位于X染色体短臂，编 码含805个氨基酸的羧肽酶，其N端17个氨基酸为信号肽，C端尾部包 含跨膜区，参与肾素/血管紧张素系统的功能调节，其作用与ACE相反， 表现为血管舒张、抗炎和抗凋亡等，且其为跨膜蛋白、不能被分泌到胞外。 基于S蛋白/ACE2的相互作用，ACE2也成为了药物开发的靶点。研究发 现，胞外区ACE2可溶重组蛋白(氨基酸1-740)能够结合S蛋白，可以 起到阻断病毒与胞膜ACE2受体结合的作用，目前临床I期试验在健康受试者表现出一定的安全性，有研究团队计划开展COVID-19的临床安全性 和有效性评估。由此可见，可溶性ACE2蛋白用于拮抗SARS-CoV感染的 重组蛋白药物研究现已有报道，且现有技术大多采用胞外区1-740的片段， 分泌表达到细胞外与冠状病毒的S蛋白结合。相关的基因药物，是将编码 可溶性胞外区ACE2蛋白的序列可通过一定的病毒载体作为基因传送的工 具导入患者体内，拮抗SARS-CoV的感染。

常见的基因药物载体包括慢病毒(lentivirus)载体和腺相关病毒 (adeno-associated virus，AAV)载体，这两种载体是目前基因治疗的两大 类代表性病毒载体。然而，天然AAV基因组是单链DNA，对于单链AAV (Adeno-associated Virus，AAV)载体来说，其容量为4.7kb，能够容纳包 括启动子、可溶性ACE2编码区以及Poly A序列，但其缺点是单链AAV 载体进入细胞后转换为双链需要一定时间，使可溶性ACE2表达较滞后。

发明内容

(一)要解决的技术问题