[发明专利]重组白额高脚蛛毒素多肽及其制备方法

权利要求书

1.一种重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建含白额高脚蛛毒素多肽编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体pVT102U/α含如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中的任一核苷酸序列；

2)所述重组菌为含重组表达载体pVT102U/α的酿酒酵母，将步骤1)得到重组表达载体热击转化至酿酒酵母S78构建重组菌；

3)重组菌在YSD液体培养基中发酵培养，表达获得白额高脚蛛毒素多肽，所述重组白额高脚蛛毒素多肽为U1、U3、U4或U27中的任意一种，U1、U3、U4、U27的氨基酸序列分别如SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

2.如权利要求1所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述重组表达载体pVT102U/α为pVT102U/α-U1、pVT102U/α-U3、pVT102U/α-U4或pVT102U/α-U27。

3.如权利要求2所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中构建重组表达载体的具体操作，包括引物设计、PCR扩增、获得目的片段和构建重组表达载体。

4.如权利要求1所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中构建重组菌的具体操作为：取pVT102U/α-U1、pVT102U/α-U3、pVT102U/α-U4和pVT102U/α-U27中的任一重组表达载体，热击转化酿酒酵母，采用YSD营养缺陷筛选培养基进行营养缺陷筛选，其操作为：将重组表达载体质粒DNA1.0μg；carrier DNA，10μg；酿酒酵母菌悬液，20μL；PEG溶液(10×TE，1M LiAC,50％PEG 4000,以1:1:8的体积比混合)1.5mL加入10mL无菌管中，混合，30℃，200rpm，培养30min；42℃热击15min后，5000g，离心5min；弃上清，细胞沉淀用200μL 1×TE洗涤，5000g，离心5min；弃上清，细胞沉淀悬浮于200μL 1×TE溶液中；细胞悬浮液涂YSD板，30℃培养4-6天。

5.如权利要求1所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中重组菌发酵培养表达的具体操作为：挑取2～4个3～5mm的重组菌于3mL YSD液体培养基中，28～32℃，220～280rpm，培养12～16h；按1:20～50的比例将制备的种子液接种入50mL YSD液体培养基中，28～32℃，220～280rpm，培养12～16h；再按1:20～50的比例将制备的种子液接种入1.0L YSD液体培养基中，28～32℃，220～280rpm，培养60～72h。

6.如权利要求1～5任一项所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法还包括：

4)蛋白纯化：收集步骤3)发酵培养得到的发酵产物的上清，分离纯化。

7.如权利要求6所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述蛋白纯化的具体操作为：将发酵产物的上清和预先用0.05M Tris·HCl(pH7.5)缓冲液混合，室温放置0.5～1h，然后用抽滤瓶抽滤，所得到的滤液，pH值调至7.5后，直接上预先用0.05MTris·HCl(pH7.5)平衡好的DEAE阴离子交换柱，然后分别用含0.1M,0.3M,0.5M,1.0M NaCl的0.1M NaCl缓冲液进行洗脱，收集每个洗脱峰进一步采用RP-HPLC纯化，低温冻干。