[发明专利]基于散斑原理的荧光成像照明装置、成像系统及成像方法

说明书

本发明公开了一种基于散斑原理的荧光成像照明装置、成像系统及成像方法。所述荧光成像照明装置，包括耦合光纤束、以及一个或多个混合激发光发生单元。所述成像系统包括所述基于散斑原理的荧光成像照明装置、镜体、成像装置、以及采集控制装置。所述成像方法，包括以下步骤：控制所述系统的荧光成像照明装置交替产生形成散斑照明的荧光激发光和形成均匀光照明的荧光激发光，并控制所述成像装置进行散斑照明成像和均匀光照明成像，采用HiLo光学层析算法，获得光学层析图。本发明在现有穿戴式荧光显微系统的基础上，采用混合相干光源和非相干光源照明的方法，得到目标样品的光学层析图像，提高成像的对比度和分辨率，扩展宽场荧光显微系统的应用范围。

技术领域

本发明属于生物成像领域，更具体地，涉及一种基于散斑原理的荧光成像照明装置、成像系统及成像方法。

背景技术

对清醒和自由活动的动物的脑细胞成像是神经科学领域研究动物行为与大脑神经元之间联系的重要手段。在动物进行相应的行为过程中，观测其脑区特定区域神经元的动作电位变化，这样可以研究动物行为与神经元、环路和更高层次的神经元信息处理之间的联系。因此神经元活动信号的检测是神经科学研究的基础，电生理记录等常规手段存在技术难度大、通量低、不具特异性和缺少空间分辨率等诸多问题。光学神经探针的发展是对现代神经科学研究检测技术的重要补充，光学信号可以提供高的空间和时间分辨率，同时比传统的微电极方法侵入性更小，能够在体研究更多自然行为中神经元的功能。

配合相应的光学荧光探针，采用各种荧光显微技术可以进行单色或多色神经元活动成像，还可通过增加光遗传刺激光源，同时进行原位光遗传刺激。为了可以记录在清醒、不受约束和可移动条件下动物在自然行为中的神经功能，业内已经发展出了一种利用微型光学器件、微型成像元件和微型镜体结构实现的微型化荧光显微镜，该微型荧光显微镜体积小，镜体可固定于小鼠头部，其重量不会影响到小鼠的自由活动，目前已经开始应用于国内外的神经科学研究中。现有的微型荧光显微镜一般采用发光二极管作为光源，并需使用配套的准直透镜和窄带滤光片(如中国发明专利，申请号201510220640.8，201680077967.7和201910621446.9)，这种设计体积小、重量轻，能够实现基本的活体成像的需求。但其观察范围小，成像分辨率低，调焦十分不便。最限制其使用的缺陷是扩展性能差，难以根据实际研究需要更换/增加光波长。特别是，若想增加光波长进行多色成像或者增加光遗传功能，每增加一个光波长，就需要增加一套由发光二极管、窄带滤光片组成的光源，且需要额外增加引导光源的二向色镜，导致镜体体积增大，重量增加，装配更复杂，反而不适合戴在动物头上持续实验。针对此技术缺点，本研究小组已经提出了一种通过混杂排列的多光纤耦合光束，将成像系统的光源外置从而简化照明光路，并拓展光源发光能力的技术方案(中国发明专利，申请号201911299007.7)。由于该技术方案仍采用宽场荧光成像技术，故而该技术方案存在宽场荧光显微镜固有的图像对比度低的问题。为了解决这个问题，可以采用其它对比度更高的成像方式，例如中国发明专利201710183353.3和中国发明专利201811494384.1提出了微型双光子显微镜的技术方案以提高成像的分辨率和对比度，然而这种设计必须使用飞秒脉冲激光器及扫描控制装置，硬件成本非常高，结构复杂，且由于采用点扫描的方式，成像速度慢。

动态散斑照明显微成像是用随机散斑模式照明荧光物体采集一系列的图像，通过计算图像随时间波动的对比度来得到光学层析图。散斑是颗粒状光强分布图案，具有高对比度的特点；通过散斑图案照明得到的荧光图像因此也具有对比度，通过图片对比度可以得到样品在焦面部分的信息：在焦面处高频信息占主导，同时在离焦位置低频占主导。观察到的散斑对比度相当于荧光图片中焦面与离焦信息的比值。Mertz研究小组改进了动态散斑照明显微成像，提出一种混合散斑和均匀照明的方法(称为HiLo，Hi代表高频，Lo代表低频)，只需两次成像，经过算法计算可以得到光学层析的图像：计算散斑图像和均匀照明图像的局部对比度，得到宽场均匀照明信息中焦面低频信息，结合均匀照明中的高频信息，融合得到全分辨率的光学层析图像。