[发明专利]一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法

说明书

本发明提供了一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法，属于植物原生质体制备技术领域。本发明提供的用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物，包括纤维素酶和浸解酶，所述纤维素酶的酶活为250～350U/g，所述浸解酶的酶活为700～900U/g，所述纤维素酶和浸解酶的质量比为(14.5～15.5):(3.5～4.5)。本发明通过纤维素酶和浸解酶组合使用对毛白杨叶片和/或根组织进行酶解，既保持了原生质体的高活性，且获得的原生质体的数量多，酶的价格又相对廉价，降低了成本，可以满足后续试验研究的要求。

技术领域

本发明属于植物原生质体制备技术领域，具体涉及一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法。

背景技术

毛白杨是中国特有的乡土树种，分布广泛，在辽宁(南部)、河北、山东、山西、陕西等省均有分布，以黄河流域中、下游为中心分布区，在我国北方林业生产和生态环境建设中占有重要地位，是北方地区森林培育的先锋树种。但杨树为多年生树种，以传统的杂交育种方式进行遗传改良耗费时间较长。利用原生质体进行细胞融合和体细胞杂交，可有效改善这一缺点。杨树也是木本植物的模式物种，原生质体的获得可以为一些重要基因的科学研究提供良好的材料。目前，国内外对于杨树叶片组织原生质体的分离与培养已有一定的研究基础(WANG,1991；宋少宇，张俊琦等,2015)，但这些以拟南芥酶解为基础的方法分离杨树叶片的原生质体效率较低，目前急需一种分离效果好的杨树组织原生质体的制备方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于制备毛白杨叶片和/ 或根组织原生质体的组合物及其试剂和方法。本发明提供的用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物不仅分离效果好，而且制备得到的原生质体的活性好、数目多。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合物，包括纤维素酶和浸解酶，所述纤维素酶的酶活为 250～350U/g，所述浸解酶的酶活为700～900U/g，所述纤维素酶和浸解酶的质量比为(14.5～15.5):(3.5～4.5)。

优选的，所述纤维素酶为纤维素酶R10，所述浸解酶为浸解酶R10。

优选的，还包括甘露醇、KCl、2-(N-吗啡林)乙磺酸一水合物、 CaCl₂和小牛血清白蛋白。

优选的，包括以下浓度的组分：纤维素酶14.5～15.5g/L、浸解酶 3.5～4.5g/L、甘露醇0.5～0.7mol/L、KCl15～25mmol/L、2-(N-吗啡林) 乙磺酸一水合物15～25mmol/L、CaCl₂10～15mmol/L和小牛血清白蛋白0.9～1.1g/L。

本发明提供了上述技术方案中所述组合物在毛白杨叶片和/或根组织原生质体制备中的应用。

本发明还提供了一种用于制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的组合试剂，其特征在于，包括独立分装的试剂A、试剂B和试剂C；所述试剂A为上述技术方案中所述组合物；所述试剂B为W5溶液，所述W5溶液包括以下含量的组分：CaCl₂120～130mmol/L、NaCl150～160mmol/L、KCl3～7mmol/L和2-(N-吗啡林)乙磺酸一水合物 1～3mmol/L；所述试剂C包括以下含量的组分：PEG4000200～600g/L、甘露醇0.8～1.2mol/L和CaCl₂0.8～1.2mmol/L。

优选的，还包括独立分装的甘露醇溶液，所述甘露醇溶液的浓度为0.38～0.42mol/L。

本发明提供了上述技术方案中所述组合试剂在制备毛白杨叶片和/或根组织原生质体的应用。