[发明专利]一种修复关节软骨损伤的滑膜间充质干细胞联合PRP制剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种修复关节软骨损伤的滑膜间充质干细胞联合PRP制剂及其制备方法和应用。

2.根据权利要求1一种滑膜间充质干细胞联合PRP制剂，其特征在于，包括滑膜间充质干细胞和富血小板血浆。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述滑膜间充质干细胞为自体滑膜间充质干细胞。

4.根据权利要求3所述的滑膜间充质干细胞联合PRP制剂，其特征在于，所述滑膜间充质干细胞在所述滑膜间充质干细胞联合PRP制剂中的浓度为(1～10)×10⁷细胞/mL。

5.根据权利要求2所述的滑膜间充质干细胞联合PRP制剂，其特征在于，所述富血小板血浆为自体富血小板血浆。

6.根据权利要求5所述的滑膜间充质干细胞联合PRP制剂，其特征在于，所述自体富血小板血浆体积为2ml。

7.根据权利要求4人滑膜间充质干细胞的获得和分离培养：

步骤1：无菌条件下于膝关节髌上囊处用髓核钳取出滑膜组织，将收集的标本浸于4℃无菌生理盐水中；

步骤2：将标本移入无菌操作台，生理盐水冲洗3次，剪除脂肪和部分结缔组织，分离出平滑光亮的滑膜组织，用无菌眼科剪将滑膜剪成1.0～2.0 mm³碎块，将碎片移入15 ml的离心管；

步骤3：依次用0.1～0.5％的胰蛋白酶（30 min）和0.1～0.5％胶原酶P（2 h）在37℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中消化；

步骤4：消化结束后，经100目钢网过滤，1000 r/min离心5min弃去上清液，清洗2次，重悬细胞并计数；

步骤5：以5×10⁴个有核细胞平铺于T75培养瓶中，37℃、5%的CO₂作为原代SMSCs培养；

步骤6：24 h后换液，除去未贴壁细胞，继续培养7～14 d；

步骤7：待细胞达到80％融合时，吸出原有干细胞培养上清，加入10ml生理盐水将残留培养基洗出；2ml0.025%胰酶稀释液消化2min，加入5ml消化终止液，终止胰酶的消化；

步骤8：收集P0代滑膜间充质干细胞计数，按照细胞数1x10⁶/T175瓶接种于T175培养瓶中进行P1代培养，并再次传代；

步骤9：传代至第4代时，即为可用于治疗的滑膜间充质干细胞。

8.如权利要求4富血小板血浆的制备方法：

步骤1：在无菌条件下使用枸橼酸钠抗凝剂采集20ml外周血，转入50ml离心管中；

步骤2：1500rpm/min 离心 10min，取上清液转移至另一支50ml离心管中；

步骤3：将上步骤得到的上清2000rpm/min 离心 10min，吸弃上清液，留2ml血浆以容纳并稀释的血小板；

步骤4：取10ml生理盐水加入到红细胞沉淀管中，并充分混匀，1500rpm/min 离心10min，取上清液转移至另一支50ml离心管中；

步骤5：将上步骤得到的上清2000rpm/min 离心 10min，弃上清，收集沉淀；

步骤6：将上述所得到的血小板血浆混合物也与血小板沉淀合并，得到高浓度富血小板血浆。

9.如权利要求1至8中任一项所述滑膜间充质干细胞联合PRP制剂的制备方法，其特征在于，包括将滑膜间充质干细胞重悬于富血小板血浆中，得到滑膜间充质干细胞联合PRP制剂。