[发明专利]一种基于菠菜绿RNA可视化的方法及其应用

权利要求书

1.植物tRNA在保护和/或稳定菠菜绿RNA适配体与荧光素分子DFHBI相互作用并实现菠菜绿RNA在植物体内可视化的应用，所述植物tRNA为赖氨酸转运RNA，具体为赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA，所述赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.一种基于菠菜绿RNA可视化的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）构建赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA即KSK，具体为：直接合成5’端含有Age I，3’端含有Sma I酶切位点序列的KSK片段，克隆赖氨酸转运RNA和菠菜绿RNA，构建赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA，赖氨酸转运RNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，菠菜绿RNA核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

2）将KSK亚克隆至pEAQ-HT载体中，得到pEAQ-HT/KSK，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

3）采用基因枪法将pEAQ-HT/KSK攻击至无叶绿体的洋葱表皮细胞中，与DFHBI相互作用，在激光共聚焦显微镜下观察，具体为：采用基因枪法将pEAQ-HT/KSK攻击至无叶绿体的洋葱表皮细胞中，将洋葱表皮放置在高渗培养基上，轰击12小时后，将洋葱表皮浸润至100-200µM DFHBI溶液中30min，然后在激光共聚焦显微镜下观察到足够强的绿色荧光；

所述基因枪法具体为：采用QIAprep Spin Miniprep Kit试剂盒，提取pEAQ-HT/KSK质粒，浓缩后调至终浓度为1µg/µl，制备包裹pEAQ-HT/KSK质粒的金粉，空气中干燥，再加入30µl无水乙醇，取10µl金粉加至载样膜上，利用基因枪系统进行轰击，所述包裹质粒的金粉制备方法为：称取1.5mg直径为1µm的金粉，用70%乙醇洗涤一次，用100%乙醇洗涤两次，快速离心去上清后，获得洗净的金粉，空气中干燥，加50µl的50%甘油悬浮，然后依次加入10µgpEAQ-HT/KSK质粒，50µl浓度为2.5M的CaCl₂溶液，20µl的0.1M的亚精胺，以及250µl的70%乙醇，每加入一样试剂均剧烈涡旋2-3秒，待所有试剂加完后，快速离心，去除上清，沉淀即为包裹质粒的金粉。

3.如权利要求2所述的一种基于菠菜绿RNA可视化的方法，其特征在于所述高渗培养基包括：含0.8%植物凝胶的1/2 MS固体培养基，pH=5.8，内含46.67g/L山梨醇，46.67g/L甘露醇。

4.如权利要求2所述的一种基于菠菜绿RNA可视化的方法，其特征在于所述DFHBI溶液浓度为：100µM。