[发明专利]一种CRISPR/Cas13a驱动的催化可再生电化学生物传感器及其应用

权利要求书

1.一种CRISPR/Cas13a驱动的催化可再生电化学生物传感器，其特征在于，所述CRISPR/Cas13a驱动的催化可再生电化学生物传感器包括：

(a)可再生丝网印刷电极芯片，包括丝网印刷电极和装载液体样本的软体孔板，其中丝网印刷电极包括金工作电极、铂对电极和银/氯化银指示电极；

(b)氧化还原基团修饰的核酸链单分子层被锚定在金工作电极表面；

(c)CRISPR/Cas13a系统，包括Cas13a蛋白、crRNA和启动分子；

(d)具有氧化还原基团和尿嘧啶DNA修饰的发夹DNA催化回路；

启动分子为RNA修饰发夹DNA核酸链，在5’或3’末端自身形成一个12个碱基对左右的发夹结构并且内部环状结构有2到5个核糖核苷酸标记的寡核苷酸；

RNA修饰发夹DNA核酸链，RNA修饰包括腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或其中几种；

RNA修饰发夹DNA核酸链，RNA修饰位点会被激活后的Cas13a蛋白切割，从而断开并解链；

(a)两个可潜在结合成双链的发夹DNA，即C-H1和C-H2；

(b)其中一个发夹DNA的5’或3’末端标记氧化还原基团，并且5’或3’末端含有3-7个尿嘧啶碱基；

在目标核酸链存在的情况下，C-H1与C-H2会发生链式杂交反应，生成C-I2；C-I2与金电极表面的核酸单分子层结合生成复合物，C-I2与金电极表面的核酸单分子层结合生成的复合物用来做电信号检测，之后使用溶剂洗去，金电极表面的核酸单分子层是可再生的。

2.如权利要求1所述的CRISPR/Cas13a驱动的催化可再生电化学生物传感器，其特征在于，

(a)所述丝网印刷电极包括丝网印刷电极的固体基板，所述固体基板为玻璃，陶瓷，硅晶片或聚甲基丙烯酸甲酯；

(b)装载液体样本的软体孔板，所述软体孔板为聚二甲基硅氧烷(PDMS)或聚苯醚(PPO)。

3.如权利要求1所述的CRISPR/Cas13a驱动的催化可再生电化学生物传感器，其特征在于，被锚定在金工作电极表面的核酸链单分子层包括硫醇化DNA，氨基修饰的DNA，或RNA。

4.如权利要求1所述的CRISPR/Cas13a驱动的催化可再生电化学生物传感器，其特征在于，氧化还原基团包括二茂铁、亚甲基蓝或蒽醌。

5.如权利要求3所述的CRISPR/Cas13a驱动的催化可再生电化学生物传感器，其特征在于，核酸链单分子层的长度在5-50个核苷酸之间。

6.如权利要求1所述的CRISPR/Cas13a驱动的催化可再生电化学生物传感器，其特征在于，CRISPR/Cas13a系统会特异性识别目标核酸链。

7.如权利要求6所述的CRISPR/Cas13a驱动的催化可再生电化学生物传感器，其特征在于，目标核酸链包括小分子RNA(miRNA)和信使RNA(mRNA)。

8.如权利要求1-7任一所述的CRISPR/Cas13a驱动的催化可再生电化学生物传感器在定量样本中目标核酸链的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

(1)将软体孔板通过微接触粘贴技术固定到丝网印刷电极上制成芯片；

(2)加入核酸链/竞争链溶液于孔板中，在金电极表面形成自组装单分子层；

(3)将目标核酸链与CRISPR/Cas13a系统和发夹DNA催化回路混合；

(4)将(3)中的混合液滴加到装载液体样本的软体孔板中，通过分析输出的电信号来定量目标核酸链，电信号与目标核酸链的浓度成正比。

9.如权利要求8所述的CRISPR/Cas13a驱动的催化可再生电化学生物传感器在定量样本中目标核酸链的应用，其特征在于，竞争链包含与核酸链互补的碱基序列。

10.如权利要求1所述的CRISPR/Cas13a驱动的催化可再生电化学生物传感器，其特征在于，检测的体液样本包括血液、血清、血浆、尿液、唾液。