[发明专利]一种基于高通量测序的FGFRs基因突变的检测方法及探针序列

说明书

本发明涉及一种基于高通量测序的FGFRs基因突变的检测方法及探针序列，包括如下步骤：1)共提取样本基因组DNA及总RNA；2)基因组DNA进行片段化及片段化DNA回收；3)根据总RNA质控情况进行总RNA打断和/或引物杂交；3)合成cDNA第一链；4)合成cDNA第二链；5)将片段化后的DNA与cDNA混合构建混合文库；6)采用捕获探针进行杂交和捕获；7)捕获后文库扩增及纯化；8)高通量测序及突变分析。本发明能够检测FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4基因单碱基突变、插入缺失突变及融合突变及相对表达量分析。

技术领域

本发明涉及一种基于高通量测序平台开发的FGFRs(FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4)基因突变检测方法。

背景技术

成纤维细胞生长因子受体(FGFRs)是高度保守，分布广泛的跨膜酪氨酸激酶受体。它们参与发育，分化，细胞存活，迁移，血管生成和致癌作用。目前，国内外顶尖药企，正在研发多种FGFR靶向药，包括Erdafitinib(厄达替尼)、BGJ398、AZD4547和BLU-554等第一代药物，其中Erdafitinib已经获批上市，同时针对一代耐药后的第二代FGFR靶向药TAS-120也都处于临床评估阶段，针对这些靶向药物的用药靶点的伴随诊断临床检测需求也日渐旺盛。在人类中，有四种FGFR典型的酪氨酸激酶受体(FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR14)，2015年在clinical cancer research期刊中发表了用下一代测序技术描述了来自各种癌症的4853个患者样品中FGFR的突变情况，包括突变，融合和扩增。在测序的4853种癌症中，该研究观察到343例病例中有360个FGFR突变，共涉及17个癌种，总发生率为7.1％。在360个FGFR突变中，点突变及插入缺失突变点基因约占26％，基因融合突变约占8％。

基于FGFRs基因突变类型的多样性，包括点突变、插入缺失突变、融合突变、扩增/过表达突变，临床的检测需求也是多样的，需要一种能够检测FGFRs多种突变类型的方法；同时受限于样品量，样本质量不高，以及考虑到终端检测应用的经济性。现有FGFRs基因突变检测方法有诸多不足之处。

基于荧光原位杂交(FISH)的FGFR2基因融合突变检测技术是先根据FGFR2基因上下游分别设计5’端探针组及3’端探针组，并标记不同荧光基团，通过观察显微镜下原位杂交的荧光信号分离程度，判别是否发生融合突变。该方法仅能用于鉴别FGFR2基因是否发生了融合突变，无法确定融合伴侣基因及具体断点位置，也无法检测FGFRs基因的点突变、插入缺失突变等其他突变类型。

基于单独的依靠DNA样本的扩增子或靶向捕获高通量检测技术通过设计FGFRs基因CDS区域的扩增引物或捕获探针，也可以实现对FGFRs基因点突变、插入缺失突变的检测，但对于融合突变检测，扩增子靶向测序技术，仅能够根据已知融合断点设计扩增引物，无法适用于融合发生于内含子区域的断点未知的DNA样本，且对样本质量也有一定要求；而对于靶向捕获测序技术，理论上捕获探针需要覆盖基因的所有内含子区域，才能覆盖所有的FGFRs基因的融合突变类型，检测区域相比于仅检测CDS区扩大15倍，预期的测序数据量及测序成本也将增加15倍，导致检测成本过高，经济性差。

基于分别依靠DNA样本及RNA样本进行的靶向捕获高通量检测技术，可以对DNA外显子区域设计扩增引物或捕获探针，实现点突变、插入缺失突变的检测，对于采用RNA样本进行融合突变检测的扩增子靶向测序技术，仅能够根据已知融合断点设计扩增引物，实现已知融合突变类型的检测，不能检测未知的融合突变；而对于靶向捕获测序技术，可以实现已知融合突变及未知融合突变的检测，但2种样本类型均需要分别进行杂交捕获步骤，导致检测操作复杂，检测成本加倍，适用性及经济性较差。

综上所述，目前FGFRs突变检测方法还不够成熟，可用的检测方法，受限于本身技术原理不适用，检测突变类型不全，检测成本过高或检测操作过于复杂，无法满足日益增长的检测需求，因此，急需一种检测突变类型全面，检测成本低，检测步骤较为简单，能够满足FGFRs临床检测需求的方法。

发明内容