[发明专利]用于治疗高级别脑胶质瘤的基因修饰间充质干细胞及其制备方法

权利要求书

1.一种用于修饰间充质干细胞的融合基因，其特征在于，包含：1)编码分泌信号蛋白的核苷酸序列；2)编码NLGN-3阻断蛋白的核苷酸序列；以及3)编码人IgG1 Fc片段的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述编码分泌信号蛋白的核苷酸序列为编码tPA、IL-2或SEC分子的核苷酸序列；优选地，所述编码分泌信号蛋白的核苷酸序列为编码tPA分子的核苷酸序列；更优选地，所述编码分泌信号蛋白的核苷酸序列为SEQ IDNo.1；

所述编码NLGN-3阻断蛋白的核苷酸序列为蛋白Neurexin-1β胞外区或NLGN-3特异单克隆抗体的核苷酸序列；优选地，所述编码NLGN-3阻断蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.2；

所述编码人IgG1 Fc片段的核苷酸序列由IgG1的重链恒定区CH2和CH3以及铰链区三部分组成；优选地，所述编码人IgG1 Fc片段的核苷酸序列为SEQ ID No.3。

3.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述编码分泌信号蛋白的核苷酸序列、所述编码NLGN-3阻断蛋白的核苷酸序列、所述编码人IgG1 Fc片段的核苷酸序列依次串联组成如SEQ ID No.4所示的序列。

4.一种能够抑制脑胶质瘤细胞，特别是高级别脑胶质瘤细胞增殖的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞通过基因修饰的方法，表达特异性阻断NLGN-3与NRXN蛋白结合的融合蛋白，所述融合蛋白由权利要求1-3任一项所述的融合基因编码。

5.根据权利要求4所述的间充质干细胞，其特征在于，所述基因修饰采用的技术为利用病毒表达载体转染、脂质体转染、电转移、mRNA转染或Crispr/Cas9基因编辑的方法转染至间充质干细胞的技术；优选地，所述基因修饰为病毒转染技术；更优选地，所述基因修饰为慢病毒转染技术；更优选地，所述基因修饰为第四代慢病毒转染技术。

6.根据权利要求4所述的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞为骨髓组织、脂肪组织、脐带组织或胎盘组织来源的间充质干细胞；优选地，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。

7.一种根据权利要求4所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

(1)利用病毒载体系统构建特异性阻断NLGN-3与NRXN蛋白结合的融合基因载体质粒，

(2)将所述融合基因载体质粒与包装质粒一起导入293T细胞，收获病毒；以及

(3)将收获的病毒转染至所述间充质干细胞，筛选被病毒转染的间充质干细胞；

优选地，所述制备方法包括：

(1)构建tPA-NRXN1β-IgG1融合基因，并采用慢病毒载体系统构建pLV-NRXN1β-IgG1融合基因载体质粒；

(2)将所述pLV-NRXN1β-IgG1融合基因载体质粒和包装质粒一起导入293T细胞，包装得到成熟的慢病毒LV-NRXN1β:Fc；

(3)将收获的慢病毒LV-NRXN1β:Fc转染至所述间充质干细胞，筛选被病毒转染的间充质干细胞。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

(1)利用第四代慢病毒载体系统构建pLV-NRXN1β-IgG1融合基因载体质粒；

(2)将所述融合蛋白慢病毒载体质粒pLV-NRXN1β-IgG1与pMDLg、pRSV/REV、pMDNA2.G三种慢病毒包装质粒混合，通过LTX脂质体导入293T细胞，包装得到成熟慢病毒LV-NRXN1β:Fc，收获病毒；

(3)将收获的病毒转染至所述间充质干细胞，通过嘌呤霉素筛选被病毒转染的间充质干细胞。

9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下步骤：通过流式细胞术检测所述间充质干细胞的免疫标志物；通过ELISA试剂盒检测所述间充质干细胞上清中IgG1蛋白的表达水平；和/或通过Q-PCR方法检测所述间充质干细胞表达NRXN-1β水平。

10.根据权利要求1-3任一项所述的融合基因或权利要求4-6任一项所述间充质干细胞在制备治疗脑胶质瘤，特别是高级别脑胶质瘤，尤其是胶质母细胞瘤的药物中的应用。