[发明专利]SlugCas9-HF蛋白、含有SlugCas9-HF蛋白的基因编辑系统及应用

说明书

本申请涉及基因编辑技术领域，具体公开一种SlugCas9‑HF蛋白、含有该蛋白的重组载体、CRISPR/Cas9‑HF基因编辑系统及应用等。所述SlugCas9‑HF蛋白具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:1至少80％相同、且至少保留了R247A、N415A、T421A及R656A中的一种或两种以上突变的氨基酸序列，所述该蛋白的重组载体是将编码SlugCas9‑HF蛋白氨基酸的基因序列连接到基础载体上而得，CRISPR/Cas9‑HF基因编辑系统由SlugCas9‑HF蛋白和sgRNA组成，其可以高特异性编辑靶基因，编辑效率高，脱靶率在2.87%以内。

技术领域

本申请属于基因编辑技术领域，具体涉及一种SlugCas9-HF蛋白、含有SlugCas9-HF蛋白的基因编辑系统及其相关应用。

背景技术

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为抵御外源病毒或质粒入侵而进化的一种获得性免疫系统。在CRISPR/Cas9系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)、tracrRNA(trans-activating RNA)以及Cas9蛋白形成复合体后，识别靶位点的PAM(Protospacer AdjacentMotif)序列，crRNA会与靶向DNA序列形成互补结构，Cas9蛋白行使切割DNA的功能，使DNA发生断裂损伤。其中，tracrRNA和crRNA通过连接序列可以融合成为单链指导RNA(singleguide RNA，sgRNA)。当DNA发生断裂损伤后，细胞内的两种主要DNA损伤修复机制负责修复：非同源末端连接(Non-homologous end-joining,NHEJ)和同源重组(homologousrecombination,HR)。NHEJ修复的结果会引起碱基的缺失或插入，可以进行基因敲除；在提供同源模板的情况下，利用HR修复可以进行基因的定点插入和碱基的精确替换。

除了基础科研外，CRISPR/Cas9还具有广泛的临床应用前景。利用CRISPR/Cas9系统做基因治疗时，需要把Cas9和sgRNA导入到体内。目前做基因治疗最有效的表达载体是AAV病毒。但是AAV病毒包装的DNA一般不超过4.5kb。SpCas9因为PAM序列简单(识别NGG)和活性高而得到广泛应用。但是SpCas9蛋白有1368个氨基酸，加上sgRNA和启动子，无法有效的包装到AAV病毒中，限制了其在临床中的应用。为了克服这个问题，几个小的Cas9被发明出来了，包括SaCas9(PAM序列为NNGRRT)；St1Cas9(PAM序列为NNAGAW)；NmCas9(PAM序列为NNNNGATT)；Nme2Cas9(PAM序列为NNNNCC)；CjCas9(PAM序列为NNNNRYAC)，但是这些Cas9或者容易脱靶(即非靶向位点切割)，或者PAM序列复杂，或者编辑活性低，难以广泛应用。因此，寻找编辑活性高、特异性高，PAM序列简单的小型CRISPR/Cas9系统是解决上述问题的希望所在。

发明内容

针对上述问题，本申请提供一种SlugCas9-HF蛋白、含有SlugCas9-HF蛋白的基因编辑系统及应用。

第一方面，本申请提供一种SlugCas9-HF蛋白，采用如下的技术方案：

一种SlugCas9-HF蛋白，是氨基酸修饰蛋白，在SlugCas9上引入R247A，N415A，T421A，R656A突变而得到的，所述的SlugCas9蛋白属于路邓葡萄球菌属(Staphylococcuslugdunensis)，所述SlugCas9蛋白的UniProt的检索号为A0A133QCR3；