[发明专利]生产L-乳酸的重组大肠杆菌及其应用

说明书

本发明公开了生产L‑乳酸的重组大肠杆菌及其应用。本发明所要保护的重组大肠杆菌不含有D‑乳酸脱氢酶基因，含有L‑乳酸脱氢酶突变体基因，所述重组大肠杆菌表达所述L‑乳酸脱氢酶突变体基因，所述L‑乳酸脱氢酶突变体基因编码氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质。使用该重组大肠杆菌厌氧发酵48小时后，L‑乳酸产量达150g/L，产率达1.90mol/mol，光学纯度接近100％，表明本发明所构建获得的重组大肠杆菌可高产高光学纯度的L‑乳酸，可应用于在生物发酵领域中生产高品质L‑乳酸。

技术领域

本发明涉及工业微生物领域，具体涉及生产L-乳酸的重组大肠杆菌及其应用。

背景技术

L-乳酸作为一种重要的有机酸，被广泛用于食品、医药、烟草和化工等行业。另外，随着对绿色环保型材料需求的增加，未来L-乳酸最重要的用途是作为单体用于合成生物可降解材料聚乳酸(PLA)。聚乳酸作为一种新型的生物可降解材料，因其优异的综合性能被广泛用于服装、建筑、农林业和医药行业。同时，聚乳酸因使用后可以被自然界中的微生物完全降解生成二氧化碳和水而被公认为是一种环境友好材料。因此，随着PLA应用越来越广泛，L-乳酸在未来的市场潜力也将越来越大。

乳酸生产方式主要包括微生物发酵法、化学合成法和酶催化法。其中，酶催化法由于发酵方法复杂，尚未有工业化生产使用。化学法可实现乳酸的大规模连续化生产，且合成乳酸也已得到美国食品和药品管理局(FDA)的认可，但其原料主要是石油基化学品，因此受原油供应及价格波动影响较大。另外，化学合成涉及大量有毒物质且生产的乳酸没有光学特异性，因此工业中应用相对较少。以可再生原料，如玉米淀粉或木薯粉等为底物利用微生物通过发酵生产乳酸的方法可以高效合成特定光学特性的乳酸。目前发酵法生产的乳酸约占全球乳酸生产的70％以上。

自然界中有许多天然生产乳酸的细菌，这些细菌物种丰富多样，在自然界中分布广泛，如乳杆菌属、芽孢杆菌属、双歧杆菌属和乳球菌属等。这些细菌耐酸性强，遗传改造后可以实现同型发酵生产L-乳酸。但是这些细菌发酵过程需要丰富培养基，不能利用五碳糖，这极大地提高了生产成本和下游分离纯化的成本。另外，该类菌通常使用氢氧化钙或碳酸钙作为中和剂来控制发酵pH，最终的发酵产物是乳酸钙。而乳酸钙在分离提取的过程中通常需要加入硫酸，会产生大量的硫酸钙废物，难以处理。更重要的是，该类菌生产的L-乳酸通常手性纯度都在98％以下，达不到聚乳酸生产的要求。

随着合成生物学和代谢工程的发展，通过理性设计和遗传改造获得的工程菌可以在L-乳酸手性、工程菌底物利用范围、菌株耐受性等方面显著改善乳酸生产的性能指标。因此，通过基因组范围代谢育种，设计并构建适应工业化生产需求，能够低成本、高转化率生产高光学纯度L-乳酸的工程菌株并用于生产高品质L-乳酸在生物发酵领域依旧具有很强的必要性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何高产高光学纯度高质量的L-乳酸或如何获得高转化率生产高光学纯度L-乳酸的工程菌株。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种重组大肠杆菌。

所述重组大肠杆菌不含有D-乳酸脱氢酶基因，含有L-乳酸脱氢酶突变体基因，所述L-乳酸脱氢酶突变体基因编码氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质。

所述L-乳酸脱氢酶突变体基因为下述任一种DNA分子：

c1、编码链的编码序列是序列表中序列3的89-1051位核苷酸的DNA或cDNA分子；

c2、在严格条件下与c1限定的DNA分子杂交且编码所述L-乳酸脱氢酶突变体的DNA或cDNA分子；

c3、与c1或c2限定的DNA分子具有80％以上的同一性且编码所述L-乳酸脱氢酶突变体的DNA或cDNA分子。