[发明专利]一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的工艺

权利要求书

1.一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于，该制备工艺包括：

从淫羊藿中提取淫羊藿苷的方法；

制备用于淫羊藿次苷Ⅱ酶解反应的外切葡聚糖酶；

以及通过酶解制备获得淫羊藿次苷Ⅱ。

2.根据权利要求1所述的一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于：所述制备工艺具体包括以下步骤：

(1)淫羊藿苷的提取：选取淫羊藿植物并粉碎至40-60目，并将粉碎物加入至浓度为45-85％的乙醇中进行加热回流1-4小时后得到淫羊藿粗浸膏；将淫羊藿粗浸膏加入至水和乙酸乙酯中溶解并等待其分层，将水相用乙酸乙酯萃取3-5次后合并乙酸乙酯相，并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，得干燥物；将干燥物加入至混合溶剂中进行加热回流1-4小时，过滤取滤液干燥后即得淫羊藿苷；

(2)外切葡聚糖酶的制备：将含外切葡聚糖酶基因的毕赤酵母进行发酵，甲醇诱导3～7天，离心，取发酵液上清，即获得外切葡聚糖酶粗酶液；

(3)酶解制备淫羊藿次苷Ⅱ：将5-15mg淫羊藿苷加入到pH＝6-7的磷酸钠缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，向反应体系中加入约1-10％的助溶剂二甲基亚砜和50ml外切葡聚糖酶粗酶液，得总体积200mL反应体系，500rpm条件下反应至结束，乙酸乙酯萃取3-5次，合并有机相，水洗，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸去除乙酸乙酯后得产品。

3.根据权利要求1所述的一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于：所述外切葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求3所述的氨基酸序列，其特征在于：编码所述SEQ ID NO.2氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述SEQ ID NO.4氨基酸序列的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

5.一种包含权利要求4所述核苷酸序列的表达盒，其特征在于，所述表达盒的启动子为AOX1启动子或GAP启动子。

6.一种包含权利要求4所述核苷酸序列的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的原始载体为质粒pPICZα、pPIC9K、pGAPZα。

7.一种包含权利要求4所述核苷酸序列的转化子，其特征在于，所述转化子的宿主细胞为毕赤酵母。

8.根据权利要求2所述的一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于，所述步骤(1)中，将干燥物加入至混合溶剂中进行加热回流1-4小时过滤取滤渣的操作为两次，将两次滤液合并后干燥即得淫羊藿苷；所述混合溶剂为水与甲醇按照1:2-3的体积比混合后的混合溶剂。

9.根据权利要求2所述的一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于：所述步骤(2)中，酵母发酵后的上清液可直接用于淫羊藿次苷Ⅱ的制备。

10.根据权利要求2所述的一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于：所述步骤(2)与(3)中，底物质量与发酵液上清体积用量比为1:5。