[发明专利]一种快速测定骨形态发生蛋白2活性的方法

说明书

本发明公开了一种骨形态发生蛋白‑2活性的测定方法，利用生物膜干涉技术测定BMP‑2活性，先将受体融合蛋白BMPR‑IA‑Fc与传感器结合，再通过BMPR‑IA‑Fc与BMP‑2结合，根据两者之间结合作用的强弱，即亲和常数K_D，来表征BMP‑2的活性。本发明的方法，能够快速测定骨形态发生蛋白‑2活性。

技术领域

本发明涉及一种快速测定骨形态发生蛋白2活性的方法。

背景技术

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是一类在成骨细胞系定向分化和骨形成中起重要调节作用的蛋白，是一种低分子量的酸性糖蛋白，属于转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成员。其中，BMP-2具有诱导骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)分化和增殖的作用，是目前食品和药物管理局(FDA)批准的骨诱导生长因子，用作骨移植的替代品，价格非常昂贵。人源性BMP-2由信号肽序列、前肽区以及成熟肽三个部分组成，其cDNA共长1191bp，编码396个氨基酸，其中BMP-2单体由114个氨基酸组成，两个BMP-2单体可以通过链间二硫键组成二聚体，该二聚体具有完整的蛋白质高级空间结构，具备诱导骨生成的能力。BMP-2蛋白在发育过程中不可缺少，对胚胎以及多种组织器官的形成发挥了很大的作用。另外，研究表明BMP-2能显著促进骨骼愈合、骨缺损修复、骨的再整合、软骨修复等，甚至对一些非骨性疾病的治疗都可以发挥必要的影响。

BMP-2的活性主要表现促细胞分化上，不一定能够促进细胞生长，有时候反而会抑制细胞的繁殖，而BMP-2促进细胞的分化又可以表现在多方面，因此造成定量测活的困难。BMP-2主要对细胞起到促进分化的作用，是通过提高细胞内的碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性和胶原蛋白含量来表现其促分化作用的。在体外培养细胞时，成骨细胞会向周围基质中分泌高浓度的ALP，其主要作用就是去分解周围基质中的磷酸钙盐，进而导致局部的磷脂和游离的钙离子浓度增高，而磷脂能迅速与钙离子结合然后沉积于类骨质，最终迅速钙化成骨。因此成骨细胞能够发挥成骨作用的重要标志是ALP活性提高，通过测定ALP的活性可反映促骨分化活性。目前BMP-2的生物活性主要通过BMP-2作用C2C12小鼠成肌细胞等细胞，促进细胞成骨(转)分化，然后测量细胞中ALP的活性来确定的。

然而，利用细胞培养进行BMP-2生物活性测定仅适用于纯化后的rhBMP-2，同时操作过程长、耗时，所需时间长达数天，样品需过滤保持无菌，而且测定结果易受细胞生长状态影响产生波动，无法满足快速、稳定测定活性的要求。在与细胞作用的过程中，BMP-2只有与细胞表面的受体结合后才能诱导相应的信号转导级联，发挥生物功能。

因此本领域尚需开发快速测定骨形态发生蛋白2活性的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速测定骨形态发生蛋白2活性的方法。

本发明的第一方面，提供一种骨形态发生蛋白-2活性的测定方法，利用生物膜干涉技术测定BMP-2活性，先将受体融合蛋白BMPR-IA-Fc与传感器结合，再通过BMPR-IA-Fc与BMP-2结合，通过测试两者之间结合的亲和常数K_D，来表征BMP-2的活性。

在另一优选例中，所述BMP-2为rhBMP-2。

在另一优选例中，所述传感器为AHC传感器或protein A传感器。

在另一优选例中，所述传感器经预处理后再与受体融合蛋白BMPR-IA-Fc结合，所述预处理包括以下步骤：

(i)预湿处理：所述传感器置于第一平衡液中进行预湿处理5-15min；

(ii)平衡处理：启动生物膜干涉分析仪，设置参数后将预湿后传感器置于第一平衡液中平衡120-180s；