[发明专利]一种香豆素衍生物Th-HM1及其合成方法和应用

权利要求书

1.一种香豆素衍生物Th-HM1，其特征在于，结构式为：

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2.如权利要求1所述的一种香豆素衍生物Th-HM1的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）按摩尔比1:1.8~2.3将4-（二乙氨基）-2-羟基苯甲醛、丙二酸二乙酯和催化量的哌啶溶解在无水乙醇中；将该混合物搅拌加热至回流并保持6~8小时，接着减压蒸发乙醇后加入等体积比的盐酸和冰醋酸混合溶液，搅拌加热至100~115 ℃继续反应6~8小时；反应结束后，将该溶液倒入冰水中，逐滴加入NaOH溶液，调节上述反应溶液的pH至形成大量浅色沉淀；继续搅拌30~50分钟后过滤混合物，并用水洗涤、干燥，然后用甲苯重结晶，得到化合物1；

2）将等体积的DMF和POCl₃混合，在0~10 ℃下搅拌约30分钟，接着将化合物1和上述混合物一同溶解在2.5~3.0倍体积的DMF中，并在60~65℃下搅拌10~14小时；然后倒入冰水中，加入质量浓度20%的NaOH溶液调节混合物的pH至产生大量沉淀物；过滤粗产物，用水洗涤、干燥，并在无水乙醇中重结晶得到化合物2；

3）按摩尔比为1:1.2~1.5将化合物2和脱氢乙酸溶解在氯仿中；添加催化量的哌啶，加热至回流并保持3~5分钟，接着缓慢滴加2倍量的三氟化硼乙醚，然后在该温度下回流5~6小时，待混合液冷却至室温后浓缩，柱色谱法纯化，得到纯紫黑色产物Th-HM1；

所述的化合物1和化合物2的结构式为：

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3.如权利要求1所述的香豆素衍生物Th-HM1在制备检测细胞内半胱氨酸和谷胱甘肽浓度变化的探针试剂的应用。

4.一种逐级检测半胱氨酸浓度下调进而引起谷胱甘肽浓度降低的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）、配制乙腈和PBS混合缓冲溶液，配制一系列含水量不同的乙腈和水的混合溶液，配制2 mmol/L的半胱氨酸水溶液、100 mmol/L的谷胱甘肽水溶液以及配置2 mmol/L和40mmol/L的权利要求1所述的Th-HM1的乙腈溶液；

（2）、将探针Th-HM1乙腈溶液溶于乙腈和PBS混合缓冲液中，在紫外可见光吸光光度计上监测探针Th-HM1随时间推移吸光度的变化；配置同样的溶液，以紫外吸收作为激发波长监测探针Th-HM1随着时间的推移荧光强度的变化；

（3）、将探针Th-HM1溶于含水量不同的乙腈溶液中，然后分别测试它们的吸光度，随着水含量比例增加，对应在594 nm和397 nm处的吸光度值降低，在455 nm处的吸光度逐渐增加；

（4）、将探针Th-HM1溶于纯乙腈、体积比为1:1的乙腈与水混合溶液，探针Th-HM1最终浓度均为200 µmol/L，然后将它们分别滴在单晶硅片上，待其干燥后利用扫描电子显微镜对它们的形貌进行分析；

(5)、将不同浓度的半胱氨酸水溶液、谷胱甘肽水溶液分别对含探针Th-HM1的乙腈和水混合溶液进行浓度滴定，利用紫外可见光度计监测探针Th-HM1在594 nm处的吸光度变化。

5.如权利要求1所述的香豆素衍生物Th-HM1在制备细胞成像试剂中的应用。