[发明专利]一种病毒保存液及其应用

说明书

本发明公开了一种能够保存免提取的病毒核酸样品的保存液。本发明的保存液采用非离子型表面活性剂温和裂解细胞释放病毒核酸，提供的核酸稳定缓冲液在常温运输和保存以及高温灭活病毒处理过程中有效保证病毒核酸免遭降解，降低检测假阴性结果。而且，本发明的病毒保存液中不含PCR抑制剂，可免核酸提取操作，直接作为样本模板进行后续（RT‑）PCR核酸检测实验，大大简化病毒检测流程和时间，有效提高疫情防控的反应速度和有效性。

技术领域

本发明涉及一种病毒保存液，特别涉及一种能够能保存免提取的病毒核酸样品的保存液，属于分子生物学技术领域。

背景技术

2019年底爆发的病毒感染性肺炎（COVID-19）对全人类的健康造成巨大威胁，并造成重大经济损失。快速、准确的病原诊断是有效治疗、病情监测和控制疾病蔓延的重要前提。目前，通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）筛查和确诊病患是新冠肺炎防控的主要手段。如何保证核酸检测结果的及时性和准确性对当前疫情防控具有非常重大的意义。

病毒（Virus）是一种具有比较原始的生命形态和生命特征的非细胞生物，通常由基因组和外壳蛋白构成。病毒的核酸是最难以稳定保存的生物分子之一，主要在于其存在自降解和生物酶导致的降解。因此，病毒核酸样本的保存和运输通常是决定病毒样本质量及其检测质量的关键因素，尤其是RNA病毒。因此，通常含有RNA病毒的样本建议存放于专用的病毒保存液中，并在冷藏状态下（即4℃或更低温度）保存。在烈性传染的病原核酸临床检测中，临检人员易受到传染病原暴露的威胁，需要采取严格的防护设备和措施以降低临检人员感染风险。鉴于新型冠状病毒感染聚集性发病，感染性极强，且有重症病例，并有死亡病例，根据国家卫健委颁布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》规定，感染性材料或活病毒在实验活动过程中要按照病原微生物危害程度分类中第二类病原微生物进行管理，在采用可靠的方法灭活后（例如将样品在 56℃孵育30- 45分钟或更高温度进行病毒灭活）可在BSL-1实验室操作。但是由于RNA核酸不稳定的特点，高温灭活过程可能造成病原核酸降解，进而影响检测的准确性，造成假阴性的结果。自新冠肺炎疫情发生以来，核酸检测假阴性率过高一直是各方关注的焦点，以荧光定量RT-PCR作为检测手段的新冠病毒检测的阳性率目前仅有30%—50%，极大的增加了疫情控制的难度。因此，如何在保护临检人员安全的基础上有效保存、运输病原样本，并保证后续核酸检测结果的准确性，临床上对病原核酸样本采集和保存提出了更高的要求。

此外，由于病毒保存主要是解决样本保存和运输中的问题，后续检测是以病毒核酸分离提取为前提，样本在实施PCR等核酸检测之前需要分离提纯等步骤以除去样本中的蛋白变性剂、去垢剂等裂解试剂，这增加了实验操作步骤和样本受到污染的几率。随着核酸扩增技术的发展，直接扩增技术已经开始普遍应用于核酸检测分析中，而传统的病毒保存试剂中常含有（RT-）PCR抑制剂，如果直接与PCR试剂混合，会抑制核酸扩增，因此，非免提取型病毒保存液在对接后续的直接扩增技术方面受到限制。

中国专利CN111321123A “一种免核酸提取的病毒保存液”中提供了一种包含A和B两种组分的免核酸提取DNA/RNA病毒保存液，其原理是通过A组分（pH为1.0-5.0）提供的酸性缓冲液条件下，高活性的酸性蛋白酶释放DNA/RNA核酸，使病毒毒力下降或变成无毒，再通过包含中性或偏碱性缓冲液的B组分（pH为7.0-9.0）中和A组分中的酸性缓冲液，从而使酸性蛋白酶失活，避免酸性蛋白酶对PCR等核酸扩增的不利影响。但是，DNA在酸性环境下很容易降解，特别是在pH小于5的强酸性条件下，非常不利于病毒DNA核酸的保存，即使对于RNA的保存，强酸性条件也是不利的，因此，该病毒保存液虽然能做到免核酸提取，但是其对病毒的保存效果有待进一步提高。