[发明专利]PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白及其构建方法、应用

说明书

本发明公开了PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白及其构建方法、应用，构建方法包括以下步骤：S1、依次连接PLA2R、THSD7A、C1q核苷酸序列获得目的基因，C1q重复三次，PLA2R、THSD7A之间加入Linker序列，THSD7A、C1q之间加入Linker序列，相邻C1q之间加入Linker序列；S2、在目的基因前加入真核KOZAK序列，在上游加入限制性核酸内切酶位点BamⅠ，在下游加入NotⅠ酶切位点，C端加入6*His标签序列，根据哺乳细胞偏好设计全序列基因；S3、将步骤S2获得的全序列基因与质粒进行双酶切获得酶切产物；S4、将步骤S3获得的酶切产物通过T4连接酶连接，获得重组质粒；S5、将重组质粒在哺乳细胞中表达获得PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白。通过本发明所述方法构建的融合蛋白能提高检测试剂盒的灵敏度和特异性，减少漏检和错检。

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白及其构建方法、应用。

背景技术

膜性肾病(Membranous Nephropatoy,MN)是成人肾病综合征最常见的病理类型，当今各医疗中心病理诊断技术不断成熟，MN的发病率、诊断率也逐年升高，并已成为肾病综合征最常见的病因。其病理特征为致病靶抗原与抗体结合沉积于肾小球足细胞，导致肾小球基底膜增厚和足细胞足突消失、再激活补体引起损害。MN根据发病原因和病理特点分为3种，包括特发性膜性肾病(Idiopathic Membranous Nephropatoy，IMN)、继发性膜性肾病(Secondary Membranous Nephropathy，SMN)、不典型膜性肾病(Undetered AtypicalMembranous Nephropathy，UAMN)。

PLA2R是磷脂酶A2(PLA2)的受体之一，属于脂溶性水解酶超家族，有N型和M型两种亚型，M型PLA2R是一种相对分子质量为180kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于甘露醇受体及C型外源性凝集素超家族的一员，主要由细胞内C内端、细胞外C末端和一个跨膜域组成。胞外结构包含10个结构域，其中包括半胱氨酸富含域、C型凝集素样结构域1-8和纤维链接蛋白样Ⅱ型结构域。实验表明循环中的Anti-PLA2R与足细胞膜PLA2R结合形成免疫复合物，这种免疫复合物沉积于肾小球上皮细胞下，同时激活补体系统，最终导致基底膜、足细胞损伤，肾功能紊乱，从而出现蛋白尿。

2014年Tomas等在部分IMN患者发现另一非PLA2R免疫复合物沿基底膜沉积，最终测定抗原成分为I型血小板反应蛋白7A结构域(Thrombospondin-Type 1DomainContaining7A，THSD7A)。THSD7A是一种分子量约为250KD的单次跨膜糖蛋白，定位于足细胞基底面，其分子结构由胞外部份、跨膜域和胞内尾部构成其中胞外部份为主要结构，由11个血小板反应蛋白1域、14个糖基化位点和1个精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸组成。针对THSD7A产生的特异性抗体亚型以IgG4为主，在IMN中其阳性率约3％～5％。

THSD7A和PLA2R致病机制类似，结构也类似，均为跨膜糖蛋白，其抗体亚型均为IgG4，此外两者致病过程中均由补体系统激活，最后均是形成免疫复合物沉积于肾小球上皮下导致疾病发生。

虽然采用THSD7A蛋白、PLA2R蛋白检测血清、尿PLA2R抗体以及THSD7A抗体，可以对IMN进行诊断，但是单一的蛋白的检测灵敏度和特异性较差，导致漏检和错检。

发明内容

本发明目的在于提供PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白，该融合蛋白能提高检测试剂盒的灵敏度和特异性，以减少漏检和错检。

此外，本发明还提供上述PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白的构建方法、应用。

本发明通过下述技术方案实现：

PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。