[发明专利]一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法

说明书

本发明公开了一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，属于生物技术领域。一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，利用Biobrick的方法人工体外构建蛋白酶K多拷贝菌种，具体步骤主要如下：S1、多拷贝载体构建；S2、多拷贝菌种的筛选；S3、多拷贝菌种大规模发酵；本发明利用Biobrick的方法人工体外构建蛋白酶K多拷贝串联表达盒；这种构建方法的优势在于重组质粒的拷贝数是可控的，不需要依赖于对高浓度抗性药物的筛选，也不需要进行大规模的筛选，基因剂量效应被认为是毕赤酵母表达外源蛋白的最重要的因素，多拷贝菌株的表达量比单拷贝高出很多倍，从而提高了蛋白酶K的产量，价格更低廉，使之可以被运用到各个领域。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法。

背景技术

蛋白酶K属于丝氨酸蛋白酶类，它是林伯氏白色念球菌产生的一类主要蛋白酶；因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白为唯一碳氮源的环境中生长，故将其称作蛋白酶K；蛋白酶K具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和肽键；在pH4.0到pH12.0均有活性，最适pH在7.5-8.0之间，最适温度在50-55℃之间。在0.2-1％SDS或者10mM尿素存在下，蛋白酶K显示出更高的活力，而在常用浓度的EDTA，Triton X-100，盐酸胍存在下均对蛋白酶K活力影响不大。

随着人类对疾病的认识逐步深入到基因层面，以及基因检测技术的进步，通过对各种DNA和/或RNA样本的病原性突变的检测来实现对疾病的检测和诊断；蛋白酶K主要在DNA、RNA提取过程中抑制核酸酶和原位杂交中起着重要的作用；另外，蛋白酶K可替代DEPC处理RNA抽提用的离心管和枪头,实现灭活RNase A的目的,也用于处理RNase-Free的水，为脉冲电场凝胶电泳、RT-PCR等准备无DNase、RNase的样品，提取组织中非蛋白成份时降解含有蛋白质的杂质用途(例如DNA疫苗和肝素的制备)，在生物加工过程中，如肉类嫩化，对生活和工业水中病毒污染进行消毒，作为洗涤剂中加酶洗衣粉的添加剂，和生物检测中都有很广泛的应用。

目前工业化的蛋白酶K生产菌株产酶水平低，商品酶价格较高，妨碍了蛋白酶K的应用推广，加上传统的诱变选育高产菌株的方法工作量大且效率低，具有盲目性，不利于实验的快速开展；如何制备量高和价低的蛋白酶K就成了关键，优化蛋白酶K基因的密码子和序列提高蛋白酶K活性是常用的手段，但往往工作量大且提高活性的程度有限，往往并没有很大的提升。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中优化蛋白酶K基因的密码子和序列提高蛋白酶K活性是常用的手段，但往往工作量大且提高活性的程度有限，往往并没有很大的提升问题，而提出的一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，利用Biobrick的方法人工体外构建蛋白酶K多拷贝菌种。

优选的，具体步骤主要如下：

S1、多拷贝载体构建；

S2、多拷贝菌种的筛选；

S3、多拷贝菌种大规模发酵。

优选的，步骤S1中对多拷贝载体构建具体如下：

第一步、选择载体pHBM905BDM，并将其通过CpoⅠ和NotⅠ酶切；

第二步、利用Overlapping PCR方法合成蛋白酶K片段，然后进行纯化；

第三步、使用T4 DNA聚合酶处理纯化后的目的片段，与经CpoⅠ和NotⅠ酶切后载体pHBM905BDM连接，转化大肠杆菌XL-Gold，在含Amp的LB平板上挑取转化子；