[发明专利]一种基于LC-MS技术确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征的方法

说明书

本发明提供了一种基于LC‑MS技术确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征的方法，属于生物信息学技术领域。本发明采用LC‑MS技术分别对患脂肪肝病罗非鱼和正常罗非鱼的肝脏样品进行分析，并筛选鉴定患脂肪肝病罗非鱼与正常罗非鱼之间肝脏的差异代谢物，通过对差异代谢物进行通路分析及关联性分析，能够全面且综合的分析患脂肪肝病罗非鱼肝内营养物的转化及代谢路径，确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征。本发明的方法能为阐明患脂肪肝病罗非鱼肝内异常代谢机制提供有力的理论支撑，并为鱼类营养性疾病的代谢组学研究及作用机制的阐明提供示范。

技术领域

本发明涉及生物信息学技术领域，尤其涉及一种基于LC-MS技术确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征的方法。

背景技术

罗非鱼原产于非洲，其生长性能佳，抗逆能力强，肉品质好。近年来，随着罗非鱼养殖规模的扩大，集约化程度的提高，由于环境因素引发的非寄生性鱼病日趋严重，尤其是由于饵料营养失衡，如长期投喂高糖高脂饲料，易造成鱼类肝、肾、心等代谢调控组织损伤，引起肝细胞内脂肪沉积，继而导致营养性疾病，这其中以脂肪肝的危害最为严重。虽然脂肪肝病不具有传染性但其出现常常是大规模和全面性的。脂肪肝病影响罗非鱼生长、肉质与抗病力，严重时引发传染性疾病与其他综合症，给生产造成巨大的损失，挫伤养殖户的积极性。

脂肪肝病的成因多样。目前认为过量投喂或饲料营养素搭配不平衡是导致罗非鱼脂肪肝形成的主因。然而，各种营养物在罗非鱼肝内的转化及代谢机制仍不甚明确。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于LC-MS技术确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征的方法，本发明的方法能够明晰患脂肪肝病罗非鱼肝内营养物异常的转化及代谢路径。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于LC-MS技术确定患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢特征的方法，包括以下步骤：

1)利用LC-MS技术分别对患脂肪肝病罗非鱼的脂肪肝脏组织样品、正常罗非鱼的正常肝脏组织样品及质控样品进行检测，分别得到脂肪肝脏组织样品、正常肝脏组织样品及质控样品的LC-MS检测结果，利用所述LC-MS检测结果分别构建得到脂肪肝脏代谢物文库、正常肝脏代谢物文库及质控样品代谢物文库；

2)以所述质控样品代谢物文库作为参照，去除所述脂肪肝脏代谢物文库和正常肝脏代谢物文库中的低质量数据，得到脂肪肝代谢高质量数据和正常肝脏代谢高质量数据；

3)采用PLS-DA建模分析所述脂肪肝代谢高质量数据和正常肝脏代谢高质量数据，筛选变量重要性投影VIP值1、每个物质在脂肪肝组和正常组间的倍数变化FC2或FC0.5且校正p值0.05的物质为潜在差异代谢物；

4)利用在线代谢物数据库及本地质谱图库进一步识别和注释所述潜在差异代谢物，得到差异代谢物，所述本地质谱图库通过检测标准品代谢物获得；所述差异代谢物的注释条件为：与在线代谢物数据库中化合物理论质量的质量误差10ppm且与本地质谱图库中标准品二级质谱图匹配的得分0.95；

5)对所述差异代谢物进行通路分析，得到通路影响值，若所述通路影响值0.01，表示该代谢通路为患脂肪肝病罗非鱼肝脏异常代谢的关联通路；

6)对所述差异代谢物进行关联分析，绘制代谢物网络关联图，明确各差异代谢物之间的相互关联。

优选的，在步骤1)所述检测前，还包括对所述患脂肪肝病罗非鱼的脂肪肝脏组织样品和正常罗非鱼的正常肝脏组织样品进行前处理；所述前处理包括：将脂肪肝脏组织样品和正常肝脏组织样品分别和体积百分含量为45％～55％的甲醇水溶液混合后，依次进行震荡破碎、静置、离心，收集上清液，分别得到脂肪肝脏前处理样品和正常肝脏前处理样品。