[发明专利]一种甘蓝型油菜雄性不育基因BnMS5e、cDNA、蛋白、载体、工程菌及其应用

说明书

本发明涉及一种甘蓝型油菜雄性不育基因BnMS5^e、cDNA、蛋白、载体、工程菌及其应用，属于生物育种技术领域。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述基因BnMS5^e功能缺失会严重影响雄配子减数分裂过程中染色体的行为，最终导致小孢子发育缺陷。该突变体结合保持系和恢复系可应用于油菜杂交新品种的培育。基因BnMS5^e可作为一个油菜减数分裂调控的功能基因应用于油菜基因工程雄性不育系统的创制。

技术领域

本发明涉及生物育种技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜雄性不育基因BnMS5e、cDNA、蛋白、载体、工程菌及其应用。

背景技术

目前，我国油菜杂种优势利用的雄性不育系统主要是细胞质雄性不育系统和细胞核雄性不育系统，但是细胞质雄性不育系统在油菜生产应用上存在一些不尽人意的地方。而细胞核雄性不育系统不育性稳定彻底，不存在不育胞质负效应和胞质单一化的潜在风险，一般不受恢保关系的限制，很容易获得强优势组合，在杂种优势利用中具有广阔的前景。近年来，我国在油菜雄性不育研究领域不断取得突破，大量油菜育性相关分子标记的开发、育性相关基因的克隆与功能研究，不仅推动了雄性不育在油菜杂种优势利用中的应用，也为油菜光、温敏雄性不育的研究与应用指明了方向。

Yi等在油菜中首次利用图位克隆成功克隆了油菜隐性核不育S45AB的恢复基因BnMs1和BnMs2(Yi B,Zeng FQ,Lei SL,Chen YN,Yao XQ,Zhu Y,Wen J,Shen JX,Ma CZ,TuJX,Fu TD.Two duplicate CYP704B1-homologous genes BnMs1 and BnMs2 are requiredfor pollen exine formation and tapetal development in Brassica napus.PlantJ.2010,6:925-938)。油菜隐性上位互作型雄性不育系9012A的不育基因BnMs3与拟南芥基因AtTic40同源，BnMs3基因主要参与油菜雄蕊绒毡层发育(Dun XL,Zhou ZF,Xia SQ,WenJ,Yi B,Shen JX,Ma CZ,Tu JX,Fu TD.BnaC.Tic40,a plastid inner membranetranslocon originating from Brassica oleracea,is essential for tapetalfunction and microspore development in Brassica napus.Plant J.2011,68:532-545；Li J,Hong DF,He JP,Ma L,Wan LL,Liu PW,Yang GS.Map-based cloning of arecessive genic male sterility locusin Brassica napus L.and development ofits functional marker.Theor Appl Genet.2012,125(2):223-234；Dun XL,Shen WH,Zhou ZF,Xia SQ,Wen J,Yi B,Shen JX,Ma CZ,Tu JX,Fu TD,LagercrantzU.Neofunctionalization of duplicated Tic40 genes caused a gain-of-functionvariation related to male fertility in Brassica oleracea lineages.Plantphysiol.2014,166:1403-1419)。进一步研究认为，9012A的育性只受2个位点(Bnms3和Bnrf)互作控制，BnMs4、BnRf和Bnrf之间是复等位基因(董发明,洪登峰,刘平武,谢彦周,何庆彪,杨光圣.甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育系9012AB遗传模式新释.华中农业大学学报,2010,29(3):262-267；俎峰,夏胜前,顿小玲,周正富,曾芳琴,易斌,文静,马朝芝,沈金雄,涂金星,傅廷栋.基于分子标记的油菜隐性核不育7-7365AB遗传模式探究.中国农业科学,2010,43(15):3067-3075)。后期在成功克隆BnRf基因基础上，解析了BnRf基因的功能与作用机理，明确了BnMs4、BnRf和Bnrf之间的关系(Deng ZH,Li X,Wang ZZ,Jiang YF,WanLL,Dong FM,Chen FX,Hong DF,Yang GS.Map based cloning reveals the complexorganization of the BnRf locus and leads to the identification of BnRfb,amale sterility gene,in Brassica napus.Theor Appl Genet.2016,129(1):53-64；XiaSQ,Wang ZX,Zhang HY,Hu KN,Zhang ZQ,Qin MM,Dun XL,Yi B,Wen J,Ma CZ,Shen JX,FuTD,Tu JX.Altered transcription and neofunctionalization of duplicated genesrescue the harmful effects of a chimeric gene in Brassica napus.PlantCell.2016,28(9):2060-2078)。油菜显性细胞核雄性不育系宜3A(或由其转育的不育系)的育性受到同一位点的三个复等位基因控制，BnMS5^a(恢复基因)，BnMS5^b(不育基因)和BnMS5^c(正常可育或临保系基因)，且这3个等位基因之间的显隐性关系为BnMS5^aBnMS5^bBnMS5^c(卢卫.甘蓝型油菜细胞核雄性不育恢复基因BnMs5a的克隆.[博士学位论文].武汉:华中农业大学,2013)。Xin等成功克隆了宜3A的不育基因BnMS5^b和恢复基因BnMS5^a，不育基因BnMS5^b为BnMS5^a在内含子区内转座子插入造成的功能缺失突变，BnMS5^a基因能恢复不育系(BnMS5^b)的育性(Xin Q,Shen Y,Li X,Lu W,Wang X,Han X,Dong FM,Wan LL,Yang GS,Hong DF,Cheng ZK.MS5 mediates early meiotic progression and its naturalvariants may have applications for hybrid production in Brassica napus.PlantCell.2016,28:1263-1278)。同时，Zeng等成功克隆了温敏细胞核显性不育系TE5A的不育基因BnMS5^d(Zeng XH,Yan XH,Yuan R,Li KQ,Wu YH,Liu F,Luo JL,Li J,WuG.Identification and analysis of MS5d:A gene that affects double-strand break(DSB)repair during meiosis I in Brassica napus microsporocytes.Front.PlantSci.2016,7:e1005396)。但是，不论是BnMS5^b还是BnMS5^d导致的油菜雄性不育均受温度影响，在低温条件下有花粉产生。