[发明专利]一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，

所述冻存方法包括以下操作步骤：

(11)脐带展平后，将血管及羊膜从脐带中剥离，制备得脐带华通氏胶，再将其剪至1-2mm³小块，生理盐水洗涤3-5遍；

(12)将洗涤后的脐带华通氏胶小块离心处理，离心后去除上清液体得到组织块，向组织块中加入平衡液至完全浸没组织块后停止加入平衡液，所述平衡液由二甲基亚砜和基础液按照1:8-10的质量比制成；

(13)将浸泡在平衡液中的组织块放置在3-5℃的环境中平衡处理13-16min，然后离心弃上清，得到脐带间充质干细胞组织；

(14)将脐带间充质干细胞组织加入至冻存管中后，再向其中加入冻存液后制得冻存品，将冻存品放入程序降温盒中，将程序降温盒放入深低温冰箱内，初步冻存处理后再放入液氮中冻存处理，所述冻存液由以下重量份的组分制成：1-3份二甲基亚砜，0.8-1.2份低分子右旋糖酐-40，15-20份基础液；

上述基础液包括85-95份基础培养基、8-12份血清替代物、0.8-1.5份谷氨酰胺；

所述复苏方法包括以下操作步骤：

(21)将冻存管温水浴解冻，直至轻轻摇动至管内无明显冰状物时解冻完成；

(22)将冻存管转移到超净台中，颠倒混匀后倒入到洗涤液中，离心处理，得到脐带间充质干细胞组织，所述洗涤液由以下重量份的组分制成：乙酰磺胺酸钾1-8份、水90-100份、甲醇25-35份；

(23)向脐带间充质干细胞组织中加入完全培养基，转入T75cm²培养瓶中，培养7天后进行第一次半量换液，之后每隔3天进行半量换液一次，原代细胞融合度达到78-82％时，复苏完成。

2.根据权利要求1所述一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，上述所有步骤中的离心操作，离心的转速均为1400-1600rpm，离心的时间均为4-6min。

3.根据权利要求1所述一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，上述脐带展平的具体操作为：用75％酒精将脐带充分杀菌洗涤1次，用组织剪将脐带两端剪去，再用生理盐水清洗5次，每次20ml，洗净脐带，用尖头剪将脐带剪成3-5cm长度，将脐带沿静脉血管平行方向剪开小口，将脐带展平。

4.根据权利要求1所述一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，上述基础培养基为MS培养基、B₅培养基、NT培养基中的任意一种。

5.根据权利要求1所述一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，上述深低温冰箱内的温度为零下80℃，初步冻存处理的时间为3-5小时。

6.根据权利要求1所述一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，上述步骤(21)中，水浴解冻的温度为37℃。

7.根据权利要求1所述一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，所述完全培养基为由α-MEM培养基和胎牛血清按照8-9:1的体积比混合后，向其中加入抗生素后制成，其中抗生素的浓度为50-200U/mL。

8.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，上述步骤(23)中，脐带间充质干细胞培养过程中的温度为36-38℃，二氧化碳的体积浓度为4-6％。