[发明专利]一种用于生产2-羟基-吩嗪的工程菌株及应用

说明书

本发明具体涉及一种用于生产2‑羟基‑吩嗪的工程菌株及应用。微生物农药具有良好的应用前景，其中绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)天然能够分泌2‑羟基‑吩嗪(2‑OH‑PHZ)等吩嗪类化合物，并且是一种低致病的菌株，作为工程菌株应用具有良好的前景。本发明提供了一种通过敲除负调控因子PsrA及parS的方式对绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu‑1进行改造得到2‑羟基‑吩嗪高产菌株Qlu‑1‑3。本发明构建的绿针假单胞菌Qlu‑1‑3作为一种生产2‑羟基‑吩嗪的工程菌株应用于农业生产具有重要的意义。

技术领域

本发明属于生物工程菌株的构建技术领域，具体涉及一种用于生产2-羟基吩嗪的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1-3工程菌株、以及所述菌株作为工程菌株在农业生产领域的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

世界人口的增长正在推动全球粮食需求的增长。据估计，病虫害造成世界年总产量的约40％的损失，从而造成严重的经济损失。化学杀虫剂被广泛用于预防疾病和害虫的破坏，但是由于环境和哺乳动物的安全问题，越来越多地使用农业化学剂已成为全球关注的问题，并受到广泛批评。最大限度地减少化学农药的使用并寻找替代方法，已经刺激了基于微生物的方法的使用，这是一种有效且对环境敏感的方法。因此，源自微生物的农药已成为农业可持续性计划的重要组成部分。

吩嗪是一种含氮杂环色素，是假单胞菌和链霉菌分泌的一类生物活性物质，它们在菌株与其他生物之间的相互作用中起着重要的作用。当前，吩嗪-1-羧酸(PCA)，2-羟基吩嗪(2-OH-PHZ)，吩嗪-1-羧酰胺(PCN)和绿脓菌素(PYO)被广泛使用，其中2-OH-PHZ在植物生物防治方面有良好的效果，应用潜力广阔。绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1能够分泌吩嗪-1-羧酸(PCA)、2-羟基-吩嗪-1-羧酸(2-OH-PCA)、2-羟基-吩嗪(2-OH-PHZ)三种具有抗真菌作用的吩嗪类化合物，但野生型绿针假单胞菌Qlu-1(Pseudomonaschlororaphis)的2-羟基-吩嗪产量较低，大约只有6.5mg/L，通过基因工程手段提高绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)中2-羟基-吩嗪的产量具有重要的意义。

根据目前研究结果，绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)中吩嗪类物质的合成主要以4-磷酸-赤藓糖(E4P)与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)经莽草酸途径合成分支酸，分支酸酸通过吩嗪合成途径合成吩嗪类物质。依据常规的研究思路，通过敲除负调控基因、增强吩嗪合成的前体途径-莽草酸途径、删除吩嗪合成的竞争途径、优化phzO基因的密码子提高PCA转化2-OH-PHZ的效率等措施有望实现2-羟基-吩嗪产量的提高。但事实证明，由于多数调控因子、合成底物均参与了吩嗪类物质的多项代谢途径，因此，上述调控策略并不是完全有效的。

发明内容

针对上述背景技术中的记载，本发明目的在于针对野生型绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)通过基因工程改造获得性能提升的菌株。绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1，是从中国潍坊的蔬菜根际分离出的一株P.chlororaphis菌株。它具有用于吩嗪合成的典型基因簇phzABCBEFG，并且可以产生吩嗪类物质，例如吩嗪-1-羧酸(PCA)和2-羟基吩嗪(2-OH-PHZ)。基于上述研究目的，本发明利用无痕敲除的方法敲除相关负调控基因，使2-OH-PHZ产量提高了近20倍，达到130mg/L左右，为后续利用绿针假单胞菌生产2-OH-PHZ奠定基础。

基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：