[发明专利]一种基于实时荧光RT-PCR的新型冠状病毒核酸快速检测方法

说明书

本发明提供一种新型冠状病毒核酸快速检测方法，用标记不同的荧光探针在同一个PCR反应管中利用一步法实时荧光RT‑PCR方法同时检测新型冠状病毒核酸的ORF1ab、E基因及N基因，根据检测到的Ct值判断是否有病毒RNA存在于样品中。本发明在一个PCR反应管中同时检测新型冠状病毒基因的三个重要区域ORF1ab、E基因和N基因，检测成本低、通量多、灵敏度高、准确性好。本发明操作简单，只需将样品提取的RNA进行实时荧光RT‑PCR扩增检测即可。本发明检测速度快，整个检测过程只需要60分钟，满足临床快速检测需求。

技术领域

本发明涉及新型冠状病毒肺炎（COVID-19）核酸检测技术领域，具体涉及一种在同一PCR反应管中同时检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的ORF1ab、E基因及N基因的逆转录-实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测方法。

背景技术

SARS-CoV-2是一种由包膜包被的单股正链RNA病毒，其基因序列与蝙蝠冠状病毒一致性高达96%，在分类学上SARS-CoV-2与高致病的严重急性呼吸综合症人冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）同属β-冠状病毒。

疫情初期，在疫苗和抗病毒药物匮乏的情况下，早期诊断和隔离成为治疗COVID-19患者和控制疫情传播的有效措施。至今，SARS-CoV-2核酸检测仍是COVID-19诊断的金标准。根据我国《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第八版）》的要求，对COVID-19 疑似病例的确诊需满足实时荧光RT-PCR检测SARS-CoV-2核酸阳性，或通过基因测序，与已知的SARS-CoV-2高度同源；治愈者出院需满足连续两次呼吸道标本核酸检测阴性。与基因测序法相比，实时荧光RT-PCR检测快速、灵敏度高、成本低，而且根据标准曲线可以对患者体内的病毒进行相对定量，从而有助于监视疾病进程，帮助临床医生制定合理的治疗方案。基于上述优势，实时荧光RT-PCR方法仍被作为当前检测SARS-CoV-2的金标准。

自新冠疫情发生以来，大量的应急试剂盒被研发，截至2020年7月13日，国家药品监督管理局已批准了16个SARS-CoV-2核酸检测（荧光PCR法）试剂盒。基于SARS-CoV-2的基因序列与其他高致病冠状病毒高度相似，我国临床诊断优先推荐使用能同时检测SARS-CoV-2开放读码框1ab（ORF1ab）和核壳蛋白（N）基因区域的实时荧光RT-PCR试剂盒。然而，目前的新冠病毒核酸检测试剂盒几乎都是单基因单管检测，因此需要消耗大量的试剂，导致检测成本高。另外，临床上一些假阴性结果使得实时荧光RT-PCR的检测准确性备受质疑。多项研究表明，对不同的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒的检测性能进行比较分析发现，不同厂家的病毒核酸检测试剂对弱阳性样品的检测能力有差异，部分试剂的准确性、灵敏度及重复性欠佳。此外，较长的检测时间也限制了实时荧光RT-PCR对疑似人群的大规模筛查。

因此，优化和改善实时荧光RT-PCR检测方法对于更好地大规模筛查疑似患者和控制疫情非常重要。

发明内容

鉴于现有技术的上述缺陷，本发明目的在于提供一种在同一PCR反应管中同时检测SARS-CoV-2的ORF1ab、E基因及N基因的核酸检测方法，该检测方法简单、快速、通量多、成本低，同时该方法能保证检测的灵敏度和准确性，易于大规模推广。

为实现上述目的，本发明提供了一种利用一步实时荧光RT-PCR法对SARS-CoV-2的ORF1ab、E以及N基因在同一PCR反应管中同时检测，所述方法包括以下步骤：

（1）参考中国疾控预防控制中心（Zhu N, et al., N Engl J Med. 2020, 382, 727-733）和Corman等（Corman VM, et al., Euro Surveil. 2020, 25.）公布的SARS-CoV-2核酸检测引物和探针序列，制备针对SARS-CoV-2的ORF1ab基因、E基因及N基因的特异性引物和探针。引物和探针序列见表1：

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