[发明专利]通过IGFBP5介导动脉粥样化的动物模型及建立方法

权利要求书

1.通过IGFBP5介导的动脉粥样硬化动物模型，其特征在于，所述动物模型通过外源注射腺相关病毒系统性高表达IGFBP5得到。

2.一种权利要求1所述的通过IGFBP5介导的动脉粥样硬化动物模型的建立方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

步骤1、构建腺相关病毒表达载体AAV-IGFBP5；

步骤2、将步骤1得到的所述腺相关病毒载体AAV-IGFBP5通过肌肉注射到ApoE^-/-小鼠中，注射后采用高脂饲料喂养6周，6周后得到的小鼠即得到本发明的动物模型。

3.根据权利要求2所述的通过IGFBP5介导的动脉粥样硬化动物模型的建立方法，其特征在于，所述步骤1中腺相关病毒表达载体AAV-IGFBP5具体构建步骤如下：

步骤1.1、采用根据已知目的基因IGFBP5 cDNA序列设计合成扩增引物，上游引物如SEQID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示，用PCR法扩增目的基因IGFBP5，扩增条件：98℃，3min；98℃，10s；55℃，15s；72℃，1min，35个循环；72℃，10min；4℃，5min，扩增完毕用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物；

步骤1.2、将步骤1.1所得的目的基因PCR产物用Bam HI、Xhol内切酶双酶切，同时用这两种酶内切酶切割rAAV载体，将切割后的目的基因与rAAV载体混合，用T4 DNA连接酶在4℃的条件下连接12h，将连接得到的产物转化到E.coliDH5α感受态细胞中，经Kan+LB培养基培养后采用碱裂解法提取重组质粒，对得到的重组质粒进行阳性克隆鉴定；

步骤1.3、采用骤1.2鉴定正确的质粒转化E.coliDH5α感受态细胞，挑取单克隆、摇菌和质粒提取，所提取的质粒转染到HEK293细胞，培养72h后将细胞离心收集，在4℃的条件下，于53 000r/min高速离心30h，收集富含rAAV的细胞上清液；

步骤1.4、将步骤1.3中得到的细胞上清液加入树脂柱进行柱纯化，收集最终得到的纯化后的病毒，于-80℃保存。

4.根据权利要求3所述的通过IGFBP5介导的动脉粥样硬化动物模型的建立方法，其特征在于，所述步骤1.3中转染前1天将HEK293细胞于直径为100mm的培养皿，转染时细胞密度75％-85％。

5.根据权利要求2所述的通过IGFBP5介导的动脉粥样硬化动物模型的建立方法，其特征在于，所述步骤2中高脂饲料的胆固醇和脂肪量均为1.5％cholesterol+15％fat。

6.根据权利要求2所述的通过IGFBP5介导的动脉粥样硬化动物模型的建立方法，其特征在于，所述步骤2中注射入ApoE^-/-小鼠的腺相关病毒表达载体AAV-IGFBP5的浓度是1×10¹¹vp/mL。