[发明专利]识别铜绿假单胞菌的DNAzymes及筛选检测方法与用途

说明书

本发明公开了一种用于特异性识别铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的DNAzymes，本发明共得到2条铜绿假单胞菌特异性识别和切割的DNAzymes及其底物。本发明还详细阐述了该DNAzyme的筛选及检测方法与用途。特异性识别铜绿假单胞菌的DNAzyme可形成特殊loop环的二级结构，其对铜绿假单胞菌具有特异性识别作用，荧光标记的DNAzymes可检测10supgt;6/supgt; CFU/mL铜绿假单胞菌,检测范围为大于1×10supgt;6 /supgt;CFU/mL。通过动力学检测，其切割速率为0.0167 minsupgt;‑1/supgt;。所述的DNAzymes可被应用于铜绿假单胞菌的检测。

技术领域

本发明属致病菌检测和分子生物学技术领域，具体涉及可用于铜绿假单胞菌（ Pseudomonas aeruginosa）特异性检测的DNAzymes及其筛选方法，以及其用于检测铜绿假单胞菌的方法与用途。

背景技术

铜绿假单胞菌（ P. aeruginosa）是自然界中广泛分布的一种革兰氏阴性杆菌，也是人体皮肤、呼吸道常见的条件致病菌。其致病特点为引起继发性感染，多发生在机体免疫力降低时。铜绿假单胞菌能引发鱼的赤皮病，使鱼体出血发炎，鳍片脱落，严重危害水产养殖。铜绿假单胞菌具有很强的生存能力和耐药性，在饮用水的生产过程中不易被消除，WHO已将铜绿假单胞菌作为瓶装矿泉水污染危害的指示菌。铜绿假单胞菌还是住院患者特别是ICU 患者感染的重要病原菌，能导致人囊性肺纤维化、角膜炎、胃肠道感染和败血病等。

DNAzyme是通过体外筛选获得的具有催化活性的DNA寡核苷酸。DNAzyme具有结构稳定，分子相对较小、催化效率高、易于合成和修饰，不会引起机体免疫反应等优点。DNAzyme一般是从10¹³~10¹⁵个随机DNA文库中筛选得到的具有RNA特异性切割功能的单链DNA序列。这些用于体外筛选的随机文库，两端为固定的引物序列，中间由固定数目的A、T、G、C四种碱基随机排布。1994年第一个DNAzyme被报道用于RNA金属离子切割。在金属离子的作用下，DNAzyme完成催化切割的主要机理是：在底物的脱氧核糖核苷碱基上的2’-OH攻击与之毗邻的磷酸二酯键中的磷原子，使其电位发生转变，从而使底物的DNA链发生断裂，达到切割效果。其筛选流程主要包括：随机文库和引物的设计与合成；初始筛选文库的连接与纯化；正筛选和反筛选；聚合酶链式扩增（PCR）和克隆测序。一般DNAzyme的筛选过程持续4~20个循环（视筛选目标而定），期间不断引入反筛选以提高所得目标序列的特异性。

目前，国内外对铜绿假单胞菌的研究主要体现在其血清型（Serotype）、基因型（Genotype）、毒力因子（Virulence factor）及免疫特性（Immune characteristics）等方面的研究。虽然检测检测铜绿假单胞菌的方法有很多，但大多数方法花费时间长，价格昂贵且不适合现场使用。例如，细胞培养通常需要几天的时间完成，而基于抗体的测定需要多次清洗且价格昂贵。恒温扩增技术需要引物多且设计复杂，产物回收测序也困难。PCR需要DNA提取，多次试剂和热循环，而且可能提取到已经死亡细胞的DNA。目前，DNAzyme的筛选主要集中在金属离子、微生物细胞、蛋白质以及小分子等方面。尽管已有细菌相关的DNAzyme被研究报道，但未见DNAzyme检测铜绿假单胞菌的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种新的用于铜绿假单胞菌特异性检测的DNAzymes，可以实现铜绿假单胞菌的简单、快速、精确检测。

本发明的又一个目的是提供所述DNAzyme的筛选方法。

本发明的另一个目的是提供所述DNAzyme用于检测铜绿假单胞菌的用途与检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：