[发明专利]一株表达新城疫病毒耐热HN蛋白的重组杆状病毒及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一株表达新城疫病毒耐热HN蛋白的重组杆状病毒及其制备方法与应用。该病毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：V202044。其制备方法是对新城疫病毒非耐热LaSota株的HN基因进行点突变，包含G49E、R269S、G293E、R353Q和G494D，将突变HN基因插入至杆状病毒基因组上，通过病毒拯救获得重组杆状病毒rAC‑HN‑N5株。该毒株可以高效表达突变HN蛋白。与LaSota株的野生型HN蛋白相比，突变HN蛋白的热稳定性显著增强。利用重组杆状病毒rAC‑HN‑N5株表达、纯化的突变HN蛋白可用于制备新城疫耐热亚单位疫苗，以降低疫苗对冷链的依赖，为开发热稳定性良好的亚单位疫苗提供了新的思路。

技术领域

本发明涉及分子生物学和微生物学领域，具体而言，涉及一株表达新城疫病毒耐热HN蛋白的重组杆状病毒。更具体地，本发明涉及到利用同源重组技术，通过点突变的方式，对新城疫HN基因进行耐热改造，获得表达新城疫病毒耐热 HN蛋白的重组杆状病毒，以及该毒株在制备新城疫耐热亚单位疫苗方面的应用。

背景技术

新城疫(Newcastle disease)是一种急性、高度接触性传染病，其病原为新城疫病毒，该病毒在世界范围内引起广泛的家禽和野鸟感染，给世界养禽业造成了巨大的经济损失。NDV(Newcastle disease virus)属于副粘病毒科、禽腮腺炎病毒属成员，是一种含有囊膜的单股、负链、不分节段的RNA病毒。NDV基因组编码6个主要结构蛋白，即核衣壳蛋白(NP)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、血凝素神经氨酸酶蛋白(HN)、融合蛋白(Fusionprotein，F)和依赖性RNA聚合酶(L)。NDV HN蛋白在结构上可分为胞内区、跨膜区和胞外区三个部分，胞外区包含受体结合位点和神经氨酸酶活性位点、参与融合蛋白的促膜融合活性，还能够诱导机体产生中和抗体，是重要的宿主保护性抗原。

新城疫的预防以免疫预防为主，传统疫苗主要是灭活疫苗和弱毒活疫苗，较大程度减少了新城疫流行带来的危害。但是，现有的疫苗大部分是以非耐热疫苗株制备的，其抗原稳定性较差，对冷链特性要求高，常因保存或使用不当而导致免疫不完全，甚至免疫失败，这也是造成非典型性新城疫频发的主要原因之一。部分新城疫病毒弱毒株具有较好的热稳定特性，如V4、TS09-C株等，此类毒株制备的耐热疫苗在气温普遍较高的南方地区和冷链系统不完善的农村得到了较好的推广应用。

亚单位疫苗是应用分子操作技术将病原保护性抗原基因克隆至表达载体中，获得抗原蛋白，以此制成亚单位疫苗，安全性好，可以克服传统疫苗的缺陷，如灭活苗免疫保护期短，灭活不彻底造成疫病传播，以及弱毒苗变异重组引起的毒力返强等现象。大肠杆菌和酵母表达系统、杆状病毒表达系统是目前常用的表达系统，其中杆状病毒真核表达系统具有高效表达、表达产物外泌性、糖基化和磷酸化等优势，保留了天然蛋白质的免疫原性、抗原性等生物学特性。研究表明 NDV与HN蛋白的热稳定性一致，目前表达的均为不耐热毒株的HN蛋白，因此如何制备出热稳定性好、对冷链运输系统依赖较低的新城疫亚单位疫苗是本领域研究人员亟待解决的问题。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中的不足，提供了一株表达新城疫病毒耐热HN 蛋白的重组杆状病毒及其制备方法与应用。

一株表达新城疫病毒耐热HN蛋白的重组杆状病毒rAC-HN-N5株，该病毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：V202044，保藏时间为2020年8月28日。

优选地，所述重组杆状病毒rAC-HN-N5株是以杆状病毒为骨架，将突变的新城疫病毒LaSota株HN基因插入至杆状病毒的基因组。

所述的突变的新城疫病毒LaSota株HN基因包含有5个氨基酸突变，分别为第49位的G突变为E、第269位的R突变为S、第293位的G突变为E、第 353位的R突变为Q和第494位的G突变为D。所述的突变的新城疫病毒LaSota 株HN基因序列为SEQ NO：1。